Nós gostaríamos de agradecer o apoio de EUA Institutos Nacionais de Saúde concede R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 e R01EB007279 e American Heart Association conceder 0855772D.

1. Amplo campo de visão de imagem de pO2 na vascularização cortical de um rato <ol><li> Ratos (250 g -350 g) são inicialmente anestesiados com isoflurano, e da artéria femoral e da veia cateterizada são para monitor de freqüência cardíaca, pressão arterial e gases sanguíneos, bem como para perfusão intravenosa. Temperatura corporal é mantida a 37 ± 0,1 ° C. Traqueostomia é realizada, e os ratos são ventilados com uma mistura de ar e oxigênio. </li><li> Amostras de sangue para medir os gases do sangue são realizadas a cada 30-45 min e ventilação e anestesia são ajustados para manter os gases no sangue dentro de faixa fisiológica normal. </li><li> A janela fechada do crânio sobre o osso parietal milímetros 4 x 4 mm de tamanho está preparado para a imagem. O osso e dura são removidos ea janela cranial é cheio de agarose 1,5% e selado com uma lamela de microscópio. Um adicional de 1 mm 2 orifício de trepanação no osso frontal é usado para induzir CSD por microinjeção intracortical de KCl (~ mL 10, 1 M). Extremo cuidado deve ser tomado para evitar qualquer dano da vasculatura cortical. Excesso de calor, pressão mecânica, ou breve período de hipóxia pode comprometer a barreira hemato-encefálica e causam vazamento do corante da vasculatura para o espaço intersticial. </li><li> Uma máscara de material opticamente opaco é colocado ao redor janela craniana. O propósito da máscara é para absorver sinal de fosforescência que está vindo do corante que vazou para o tecido a partir das bordas da dura-máter. O corante no espaço intersticial é a fonte da fosforescência muito brilhante que pode estragar a medição. O brilho maior do corante no espaço intersticial é resultado do acúmulo do corante no meio ambiente com baixa pressão de oxigênio e taxa de resfriamento de baixa. Os danos da vasculatura em experimento é, portanto, facilmente reconhecida pelo aparecimento de manchas brilhantes fosforescência, caso em que os dados experimentais é rejeitada. </li><li> Após o término da cirurgia, o isoflurano é interrompido e anestesia é comutada para alphachloralose (50 mg / kg em bolus seguida de 40 mg / (kg h) infusão). </li><li> Animal é transferido em um carro com ventilador pressão arterial e controlar a temperatura. Ao respirar o ar ambiente, o animal está rapidamente se mudou para a configuração de imagem e recolocado para o medidor de vazão com a mistura apropriada de ar e oxigênio. </li><li> A moldura estereotáxica que mantém o animal é colocado no âmbito do objectivo. A janela do crânio está centrada no campo de visão no âmbito do objectivo e posicionado paralelo ao plano focal. </li><li> O laser pulsado é ligado e definido para a energia mínima do pulso. O feixe óptico é dirigido para pulso medidor de energia e energia de pulso entregue a amostra é ajustado para não ser superior a 10 mJ / cm 2. O iss feixe centrado na janela cranial com ângulo de incidência oblíqua de ~ 60 graus e iss a laser desligado. </li><li> Medições dos gases sanguíneos e ajustes da ventilação e anestesia são realizadas até que todos os parâmetros fisiológicos do animal foram dentro da faixa fisiológica normal. </li><li> Assumindo que o volume de sangue é de aproximadamente 7% do peso corporal, uma quantidade adequada de R3 fosforescência sonda Oxyphor é dissolvido em 1 mL de solução salina para atingir 4 x 10 -5 M concentração sanguínea da sonda. A solução da sonda é injetado através da veia femoral. </li><li> Uma solução 1 M de cloreto de potássio é preparada e ~ ul 1 é injetado com a seringa através do orifício de trepanação no osso frontal para induzir CSD. </li><li> O laser é ativado e imagem é iniciado imediatamente após a injeção da solução de KCl. Imagem de fosforescência é realizada durante ~ 10 min. </li><li> Outra medida de gás de sangue é realizada para confirmar que os parâmetros fisiológicos dos animais ainda estão dentro da faixa normal. </li><li> Vidas fosforescência são obtidos para todos os pixels ajustando o decaimento exponencial simples com encaixe quadrado não-linear com ponderação estatística em Matlab. Vidas fosforescência são convertidos para o pO2 valores usando uma relação empírica Volmer-como Stern (vide infra). </li></ol> 2. Alta resolução de dois fótons pO2 imagem em micro vasculatura cortical de um rato <ol><li> Os ratos são anestesiados com a artéria femoral e isofluorene é cateterizada para monitor de freqüência cardíaca, pressão arterial e gases sanguíneos, bem como para a administração do corante. Temperatura corporal é mantida a 37 ± 0,1 º C e os animais estão respirando espontaneamente uma mistura de ar e oxigênio. </li><li> Uma janela cranial é preparado de acordo com a técnica desenvolvida originalmente por David Kleinfeld e Winfried Denk. Um cuidado deve ser tomado para evitar qualquer dano da vasculatura para evitar um possível vazamento do corante no espaço intersticial. </li><li> Algumas amostras de sangue para medir os gases do sangue são tomadas durante um procedimento de preparação toda e ventilação e anestesia são ajustadas para manter o gás de sanguees dentro da faixa fisiológica normal. </li><li> O animal é movido para a configuração de imagem. Um quadro modificado estereotáxica que mantém o animal é colocado no âmbito do objectivo. A janela do crânio está centrada no campo de visão no âmbito do objectivo Olympus 4X e posicionado paralelo ao plano focal. </li><li> Uma imagem da janela cranial é tirada com a câmera digital através da ocular, eo objetivo 4X é substituído com o objetivo 20X Olympus (NA = 0,95). </li><li> Medições dos gases sanguíneos e ajustes da ventilação e anestesia são realizadas até que todos os parâmetros fisiológicos do animal estão dentro de uma faixa fisiológica normal. </li><li> Assumindo que o volume de sangue é de aproximadamente 7% do peso corporal, uma quantidade adequada de a fosforescência sonda PtP-C343 é dissolvido em 0,2 mL de solução salina para alcançar ~ 15 mM concentração sanguínea da sonda. A solução da sonda é injetado através da artéria femoral. </li><li> Iniciar o experimento, definindo os intervalos de tempo desejado para a excitação de corante e coleta de emissões em cada pixel. </li><li> Adquirir uma varredura pesquisa que é uma varredura raster lenta 2-dimensional da deterioração da intensidade de fosforescência que exibe a estrutura vasculatura na profundidade atual. O objetivo é movido perpendicular à janela cranial (eixo Z) e lento scans levantamento 2D de intensidade de fosforescência são tomadas usando a potência do laser mínimo em 840 nm para encontrar os microvasos no plano de imagem. </li><li> Em cada profundidade de imagem, com base no levantamento de fosforescência scan naquela profundidade, um conjunto de pontos dentro da vasculatura são selecionados, e gravação de cáries fosforescência em cada ponto é repetido para um número predefinido de média. </li><li> Definir a quantidade desejada de média, intervalo de medição, e duração da experiência e iniciar a medição. pO 2 medições são adquiridos nos locais selecionados no intervalo de medição especificado para a duração do experimento. </li><li> Durante as medições, o software re-direciona o laser de excitação para os locais selecionados mudando a posição dos espelhos de varredura galvanômetro. Controle dos scanners galvanômetro, modulador óptico electro, e todos os outros equipamentos são realizados por software feito sob encomenda em LabView. </li><li> Vidas fosforescência são obtidos para todos os pontos selecionados pelo ajuste do decaimento exponencial simples com encaixe quadrado não-lineares em Matlab. Vidas fosforescência são convertidos para o pO2 valores usando uma relação empírica Volmer-como Stern (vide infra). </li><li> Depois de coletar os dados em várias profundidades cortical, injetar dextran-conjugado de fluoresceína corante na vasculatura para geração de imagens da estrutura microvasculatura. </li><li> Obtenção de uma pilha de imagens estruturais da vasculatura executando as imagens de dois fótons de fluorescência FITC usando um canal verde no detector de quatro canais. </li><li> Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Subcomissão Massachusetts General Hospital em Animal Care Research. </li></ol> 3. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Painel figura 1. (A) no lado esquerdo desta figura mostra um amplo campo de visão da imagem de pressão de oxigênio antes da chegada de uma onda CSD. Painel (b) do lado direito mostra a evolução temporal da pressão média de oxigênio durante CSD propagação dentro da região de interesse marcada no painel (a). Figura 2 (avi): Este filme mostra a evolução temporal da pressão de oxigênio em toda a janela do crânio durante a propagação da onda CSD. Barra de escala indica a pressão de oxigênio, em milímetros de mercúrio. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Projeção 3D da pilha vasculatura imagens. Os tons de cinza representam uma máscara navio volumétrico, criado com base na imagem estrutural. Medida pO 2 valores são codificados por cores. Barra de escala é de 200 micrômetros. Reproduzido com permissão da Nature Publishing Group. 7

<ol>
	<li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y., Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+occlusion+to+surface+and+deep+vessels+in+neocortex+via+linear+and+nonlinear+optical+absorption,+Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries.">Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries.</a> Contemporary Neuroscience Series. , (2007).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems.">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials &#38; Interfaces. , (2009).</li><li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence.">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li><li>Sakad&#382;i&#263;, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression.">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li><li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy.">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li><li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li></ol>

Demonstramos duas aplicações da medição pO2 na microcirculação cortical com base em oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência. Enquanto o primeiro método baseado em imagens CCD fornece amplo campo de visão da pO2 monitoramento, medição da pressão parcial de oxigênio na microvasculatura cortical com base em dois fótons de microscopia oferece resolução capilar e permite imagens em profundidade. Ambos os métodos proporcionam alta velocidade e alta relação sinal-ruído das medições. Além disso...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycopyrrolate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Regent Inc.</td>
<td>NDC 0517-4605-25</td>
<td>Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lidocaine HCL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc.</td>
<td>NDC 0409-4277-01</td>
<td>Used as the local anesthesia during surgeries.</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Baxter Healthcare Corp.</td>
<td>NDC 10019-360-40</td>
<td>Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Chloralose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0128</td>
<td>Used as a general anesthesia during experiments with rats.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein isothio-cyanate&#x2013;dextran</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>FD2000S</td>
<td>Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cerebral blood oxygenation measurement based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence

Monitoramento das características espaço-temporal do sangue cerebral e oxigenação dos tecidos é fundamental para uma melhor compreensão da relação neuro-vascular-metabólico. Desenvolvimento de novas modalidades pO2 medição com monitoramento simultâneo de pO2 em campos maiores de vista com maior resolução espacial e / ou temporal permitirá um maior conhecimento sobre o funcionamento do cérebro normal e também terá impacto significativo no diagnóstico e tratamento de doenças neurovasculares, tais como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer e traumatismo craniano. Modalidades de imagem óptica têm demonstrado um grande potencial para fornecer resolução espaço-temporal de imagens de alta e quantitativa de pO2 baseados na absorção de hemoglobina no visível e infravermelho próximo do espectro óptico. Contudo, a medição multiespectrais de oxigenação do sangue cerebral depende de migração de fóton através do tecido dispersores cérebro. Estimativa de parâmetros e modelagem de tecidos ópticos, que podem sofrer mudanças dinâmicas durante o experimento, é normalmente necessária para a estimativa precisa de oxigenação do sangue. Por outro lado, a estimativa da pressão parcial de oxigênio (pO2), com base de oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência não deve ser significativamente afetado pelas mudanças nos parâmetros ópticos do tecido e fornece uma medida absoluta de pO2. Sistemas experimentais que utilizam oxigênio-sensível corantes têm sido demonstrados em estudos in vivo do tecido perfundido, bem como para monitorar o teor de oxigênio em culturas de tecidos, mostrando que quenching fosforescência é uma tecnologia potente capaz de imagem precisa de oxigênio na faixa de pO2 fisiológicas. Aqui demonstramos com duas diferentes modalidades de imagem como realizar a medição de pO2 na vascularização cortical com base em imagens da vida de fosforescência. Na primeira demonstração apresentamos amplo campo de visão de imagem de pO2 na superfície cortical de um rato. Esta modalidade de imagem tem relativamente simples de configuração experimental baseado em uma câmera CCD e um laser pulsado verde. Um exemplo de monitoramento da depressão alastrante com base em tempo de vida de fosforescência Oxyphor corante R3 foi apresentada. Na segunda demonstração, apresentamos uma alta resolução de dois fótons pO2 imagem em micro vascularização cortical de um mouse. A configuração experimental inclui um costume construída microscópio dois fótons com laser de femtosegundos, eletro-óptica do modulador, e contagem de fótons-tubo multiplicador de fotos. Nós apresentamos um exemplo de imagem a heterogeneidade pO2 na microcirculação cortical incluindo capilares, usando um romance PtP-C343 tintura com maior 2-fótons seção transversal de excitação. Clique aqui para ler o artigo relacionado <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Síntese e Calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos.</a>

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Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Nós apresentamos um procedimento experimental para medir a pressão parcial de oxigênio (pO2) na vasculatura cerebral com base em oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência. Preparação de animais e procedimentos de imagem foram delineadas para ambos grande campo de visão de imagem CCD-base de pO2 em ratos e dois fótons de imagens de excitação baseada em pO2 em camundongos.

Medição oxigenação cerebral de sangue baseado em oxigênio-dependente Quenching de fosforescência

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K visualizações.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Nós apresentamos um procedimento experimental para medir a pressão parcial de oxigênio (pO2) na vasculatura cerebral com base em oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência. Preparação de animais e procedimentos de imagem foram delineadas para ambos grande campo de visão de imagem CCD-base de pO2 em ratos e dois fótons de imagens de excitação baseada em pO2 em camundongos.

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Neurociência

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Modelo de injeção de bochecha para medição simultânea de dor e comportamentos relacionados a coceira

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Mapeamento do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos: colocação de eletrodos em camundongos

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

Autor em destaque: Abordagem baseada em estimulação para melhorar o fluxo sanguíneo cerebral no modelo de Alzheimer 

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...