אנו מודים לד&quot;ר Maiken Nedergaard (אוניברסיטת רוצ&#39;סטר מרכז רפואי) על עיצוב צלחת בראש. העבודה כבר נתמך על ידי פרסים NIH אל SD (R01DA026325 ו P30AI078498 מענקי קרן KK (דנה המוח קרן תוכנית Immunoimaging, American Heart Association 0635595T והאגודה ALS [# 1112)]).

1. הכנת בעלי חיים הדמיה הערה: אנו משתמשים בעכברים c57BL בוגרים. זנים שונים מהונדס ניתן להשתמש בהתאם לשאלת המחקר. ניתוחי כלי הדם ואת הדופק oximetry הם הקלו בעכברים עם פרווה לבנה (למשל זן FVB). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את האתר כירורגית ב הספסל. כל מכשירי ניתוח יש autoclaved או לחטא עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת בדיקה רקטלית, ו ברציפות למדוד את טמפרטורת הגוף של בעל החיים לאורך כל ההליך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות תחילה 5% isoflurane. ב 15-30 S, כאשר בעל חיים לא זז, ומניחים אותו על משטח חימום (37 מעלות צלזיוס), ולהחיל מסכה הפנים למסירה רציפה של אוויר המכיל 1.3-1.5% isoflurane). לוודא כי בעל החיים אינו מגיב לגירוי כאב (למשל קמצוץ הזנב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בג&#39;ל דמעה מלאכותית כדי לכסות את עיניו של העכבר, כדי למנוע חשיפה לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכונת גילוח חשמלית, להסיר שיער FROM הראש מן הירכיים הצדדים. החל מסיר שיער (למשל Nair) לירך 2 דקות ולאחר מכן לנגב את זה בזהירות כדי להסיר את השיער הנותר. הירך זה ישמש oximetry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הקרקפת באמצעות 10% povidone-יוד פתרון ואתנול 70%. </li></ol> 2. הכנת את החלון פתוח הגולגולת הגולגולת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 5 מ&quot;מ הזנב לגולגולת, עושים חתך בקרקפת במספריים, ולקדם סנטימטר אחד. העבר העור לצדדים לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את קרום על גבי הגולגולת להחיל 10% הפתרון כלוריד Ferric לחלק העליון של הגולגולת. למחות את הפתרון עודפי שומן, לגרד את הקרומים משם עם 45 מעלות # 5 פינצטה זווית. חשוב להכין את האתר בזהירות, על מנת להבטיח את הצלחת ראש יכול להיות מחובר היטב אל הגולגולת (צעדים # 4-6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, לזהות תחומי עניין. שים לב, את התפרים הגולגולת יש להימנע, כי ג הגולגולתבאופן בלתי צפוי לשבור ברוח זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה של דבק מהיר (למשל Locktite 454) סביב שולי החלון הצלחת הראש (איור 1). מקם את הצלחת ראש בצורה כזאת, כי שטח של עניין נחשף בחלון. להפעיל לחץ קל על צלחת את הראש. למרוח כמות קטנה של דבק דנטלי כדי לפלמר דבק במהירות. החזק למשך 10 שניות תוך דבק הוא polymerizing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח כמות קטנה של דבק מהיר את הקצוות של החלון לאטום את הצלחת ראש הגולגולת. לדפוק את הראש בצלחת לבעל חיים תחת היקף לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תרגיל II Microtorque להגדיר בסל&quot;ד 6000 וקצת 005 IRF תרגיל, להסיר את כל הדבק הנוסף הגולגולת מהצלחת ראש. דבק כל שנותר בצלחת הראש יש להסיר, שכן זה יהיה אחרת להפריע מצורף מכסה זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התרגיל בסל&quot;ד 1000, ולהתחיל קידוח בגולגולת על ידי יצירת מעגל בתוך החלון את הצלחת ראש, קוטר ~ 5 מ &#39;מ. השתמש בתנועות גורפות אור כאילו אתה מצייר בעיפרון רך מאוד. עצור קידוח כל 20-30 שניות כדי להסיר אבק העצם באמצעות אוויר דחוס. הערה: צורת הפתיחה בצלחת הראש מאפשר גישה נוספת המקדח (למנתח שמאל ו ימני), מה שהופך את זה קל יותר ליצור חלון גולגולתי חוזר. בנוסף, שני חורים בצורת מזדמנות לספק את המרחב הדרוש לצורך הוספת קלארק, האלקטרודה או זכוכית אלקטרודה לתוך רקמת המוח מתחת לחלון גולגולתי למדידות polarographic או אלקטרו נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו קידוח מתקדמת, להתחפר נוצר סביב הגולגולת שלמים במרכז. להיזהר לא לתקוע את הגולגולת דליל, אבל כדי להפוך את המאורה של עובי אפילו. היזהרו במיוחד סביב כלי דם גדולים, הם לא צריכים להיות בסכנה, ואם אפשר, לא נגע אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 &quot;הרגל&quot; של פינצטה # 3 להרים (&quot;מכבה&quot;) עצם במרכז החלון. החל ירידה של artificial נוזל המוח והשדרה (aCSF) על החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב בעדינות באמצעות aCSF פינה של נייר טישו רך (למשל Kimwipe). בדרך כלל דורה פגום אחד או יותר מקומות ברחבי קצה החלון. החל באחד האתרים האלה, להרים בעדינות ולאחר מכן להסיר את דורה מפני השטח של המוח, באמצעות 45 ° פינצטה זווית # 5. בבחירת האתר בו כדי להתחיל להסיר דורה, למנוע את האזורים הסמוכים כלי דם גדולים. אם הדימום מתרחש, להחיל ירידה של aCSF ולחכות 2-3 דקות של דימום קטן לעצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.07% נמוך ההיתוך agarose מומס aCSF) תביא agarose מומסת על טמפרטורת הגוף. למחות מעל aCSF מפני השטח של המוח. יוצקים את agarose בחלון, ומכסים שקופיות זכוכית. לחצו על הכוס בעדינות לעשות קשר בין זכוכית לבין הצלחת הראש, ולחכות 10-20 שניות עד agarose הוא מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר agarose עודף כיסוי זכוכית באמצעות פינצטה ונייר רקמות רכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים קטןכמות דבק מהיר מסביב לכוס להדביק את הזכוכית לצלחת הראש. למרוח כמות קטנה של דבק דנטלי כדי לחזק את הדבק (איור 1). </li></ol> 3. הזרקה תוך ורידית וניטור חמצון בדם הערה: אנו משתמשים באופן קבוע וריד הירך ליישום תוך ורידי של טקסס אדום ולא וריד הזנב. הסיבה לכך היא זריקות וריד הירך לספק זריקות בולוס בטוח לשחזור של צבע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפרה חלקית לחשוף את החלק הפנימי של הירך השמאלית. להשתמש בקלטת כדי להבטיח חיים במצב הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לשפשף חיטוי ולאחר מכן אתנול 100% על העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך לאורך הירך המדיאלי של הברך כדי מאחה הערווה. הרקמות הרכות הפרדה באמצעות דיסקציה קהה באמצעות פינצטה # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המזרק עם 1ml μl 130 טקסס האדום (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל). צרף מחט חדשה (מד 30), לכופף את זה בזהירות על 30 °, שמירה על מסגרת משופעת למעלה. מלא Wi מחטה טקסס פתרון האדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, הכנס את המחט לווריד הירך ו להזריק 100 μl של טקסס האדום. הסר המחט לחץ קלות את הווריד עם גזה כדי לעצור את הדימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור באמצעות תפר 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניטור רציף של דם SpO 2 (על מנת להבטיח חמצון דם מספקת) למקם את החללית oximeter על הירך הימני (שממנו השיער הוסר בעבר). </li></ol> 4. שני פוטונים הדמיה הערה: אנו משתמשים Fluoview1000 אולימפוס multiphoton מערכת הדמיה (זקופה) עם Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee femtosecond טי: שא לייזר כמקור עירור. הדמיה, אנו משתמשים 10 × 0.45 NA (C-Zeiss Apochromat), או 1.05 × 25 NA (אולימפוס XLPlan N) מים טבילה מטרות. אנחנו לוקחים תמונות בעומק 12 סיביות ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים עם פיקסל להתעכב זמן של 2 μs. NADH ו-Texas Red-dextran שמחים במקביל ב 740 ננומטר, ו פלואורידescence מופרד אור עירור באמצעות מראה dichroic / כמעט IR-חסימת שילוב המסנן (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, רוצ&#39;סטר, ניו יורק, ארה&quot;ב) מחולק לשני הערוצים באמצעות מראה dichroic (505DCXRU, Chroma , רוקינגהם, ורמונט, ארה&quot;ב), ו bandpass מסוננים (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). כוח לייזר נמדד אחרי המטרה היתה 10-20 mW הדמיה בשכבה I ו 20-50 mW הדמיה בשכבה II. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר מוכן בניתוח לשלב את המיקרוסקופ. קח את התמונה הראשונית של האתר בחלון גולגולתי באמצעות תאורה בשדה בהיר בהגדלה 4x להשתמש כמפה התייחסות אחת עם ההגדלה גבוה 2 פוטון angiographies. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרב על שטח של עניין באמצעות × 10 ההגדלה. בחר תחום עניין שכבות בקליפת המוח I או II (עד 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial). אם ההגדלה גבוה יותר הוא הרצוי, השתמש × 25 אובייקטיבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הסדרה בזמן (Figuמחדש 2). אנו ממליצים להשתמש בממוצע של 3-5 מסגרות להגדיל את איכות התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום hypoxemia ידי הוספת N2 50% לאוויר כי החיה נושמת. זה יביא את רמת O2 10%. ודא hypoxemia על ידי ניטור הנתונים oximeter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיכים להקליט את הסדרה בזמן דרך hypoxemia (למשל, למשך 30 שניות), ולאחר נורמלי ברמה O2 משוחזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים לצורך חישוב חלוקת חמצן על ידי איתור, מדידה וכימות שטח של חוסר חמצן ברקמות צילינדרים ו מחומצן סביב כלי הדם. </li></ol> 5. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע גליל Krogh רקמות רדיוס ר &#39;ניתן לעשות זאת באופן ידני (איור 3) על ידי מדידת המרחק בין מרכז של כלי דם הגבול שבו הקרינה גבוהה NADH הוא זוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, השתמש חישובית חוקר עצמאי למחצה אוטומטי קביעת R רדיוס הגליל רקמות blo המרכזיr עוד כלי זה תוארה בעבר 1 בצורת משלים ו סיכם את הדיון בסעיף של פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את שטח של היפוקסיה באמצעות גישה פתוחה ניתוח תמונת התוכנה, למשל ImageJ. לשם כך, השתמש האות NADH, להגדיר סף התוחמת את האזור בעוצמה גבוהה NADH, ולאחר מכן למדוד את השטח עם הקרינה NADH גבוהות רקמות. </li></ol> 6. נציג תוצאות תרשים 2 מציג וידאו של NADH / אנגיוגרפיה תמונות במהלך hypoxemia חולף (עבור גרסת PDF של נתון זה, שנבחרו תמונות סטילס היו בשימוש). ריכוז החמצן השראה ירדה מ 21% ל 10% לתקופה של 3 דקות. רמה זו של hypoxemia המושרה בניסוי מספיק כדי לגרום היפוקסיה קשה בקליפת המוח. היפוקסיה הוביל לעלייה NADH הקרינה, תחילה באזורים שהיו רחוק יותר מן אספקת הדם העורקי. הערה רקמות NADH חדהגבולות, המייצגים גבולות רקמה נצפים דיפוזיה של חמצן microcirculation קליפת המוח. תמונה איור 3 מציג את הגיאומטריה של דיפוזיה גבולות חמצן סביב כלי המוח. ניתן להסיק Krogh קוטר צילינדר של גבולות אלה, כפי שתואר קודם 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> באיור 1. (א &#39;) מאוס עם חלון גולגולתי מוכן הדמיה. (ב) מידות לוחית הראש. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> איור 2. אנדוגני NADH ירוק הקרינה דמיינו עם הדמיה של שני פוטונים דרך החלון גולגולתי, כ 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial. כלי הדם הם דמיינו עם טקסס האדום dextran. החמצן באוויר הנשאף ירד 10% עבור 3 דקות, ולאחר מכן לשחזר 21%. סרגל קנה מידה: 50μm. &lt;img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. גיאומטריה של גבולות הקרינה NADH. מתווה הצהוב מראה הגבול של היפוקסיה תפקודית, עיגולים כחולים להראות מוקרן מחומצן (Krogh) צילינדרים. קווים כחולים להראות רדיוס הגליל, המספרים מראים רדיוס ב מיקרומטר.

<ol>
	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ברזולוציה גבוהה מידע מרחבי על דיפוזיה חמצן חשוב להבין כיצד זרימת הדם במוח מוסדר לספק חמצן לתאי המוח, כדי לענות על הביקוש מטבולית. מסורתית מדידות חמצן polarographic באמצעות קלארק בסגנון אלקטרודות זכוכית הם פולשני מאוד ויש לי ברזולוציה מרחבית נמוכה 2-3 וזמן תגובה משמעותית (טווח 2). עד כה השיטה היחידה לא פולשנית למדידת ת.ד. 2 ברקמת המוח הוא מרווה זרחני, שם קצב הדעיכה של החללית נרגש הוא יחסי ריכוז חמצן 4. שיטה זו מספקת בריכוז החמצן מדויקים, אבל דורש צבע קנייני מערכת מתוחכמת מבחינה טכנית זרחני הדמיה לכל החיים. כאן, אנו מראים גישה ישירה, פשוטה, כי ניתן לבצע במערכת שני פוטונים סטנדרטית הדמיה עם שני ערוצי flurescence. הגישה שלנו מנצלת את האות הרקמה הפנימית 5ND רק דורש ראיה מנוגדים של microcirculation קליפת המוח. בגלל הגידול, שאינו ליניארי בינארי בעיקרו של NADH הקרינה ב תפקודית הגבלת ריכוזי חמצן 1, גדל מהותית NADH הקרינה הוא ציין רק באזורים עם היפוקסיה, להגביל משמעותית מבחינה מטבולית. השלכה חשובה היא כי גבולות רקמה של דיפוזיה חמצן microvessels קליפת המוח משתקפות ישירות על ידי שינויים בצורת cylindrically בעוצמה של הקרינה NADH אנדוגני. אנו מכנים את המבנים האלה כמו גלילים Krogh, כי את הרעיון של מבנים בצורת cylindrically המגדירים את עוצמת הקול מחומצן של הרקמה הסובבת כלי דם הוצג על ידי אוגוסט Krogh כבר מזמן נצפתה בניסוי באמצעות שני פוטונים NADH הדמיה 1. Krogh תמונות צילינדרים ניתן לאסוף ב-3D על ידי לקיחת Z-מחסנית של מסגרות תמונה. הם בולטים במיוחד באזור arterioles נוקבות והם שנינות בקנהH נימי מדולדל צילינדרים 1,4 periarteriolar רקמות. כדי לספק הגדרה אובייקטיבית של R גליל רקמות Krogh רדיוס (ראה סעיף 5.2) מדדנו בעוצמה רדיאליים שלהם ערכים פיקסל במגזר מוגדר היטב בין המרכז של גליל ואת הגבול החיצוני באמצעות הפונקציה Matlab &quot;improfile&quot;. הגבול החיצוני של המגזר יש לבחור להרחיב עם מרווח ביטחון מעבר לגבול הנראה. כדי לשפר את רמת האות לרעש אנו averageed על כל קווי רדיאליים הדרושות כדי לחסן את הקטע גליל הנראה על צעדים 1 מעלות. בעוצמה וכתוצאה מכך רדיאלי הממוצע בכרטיס במגזר הציג עלייה חדה, אשר תואם את R רקמות גלוי הגבול. אנו מתאימים פונקציה sigmoidal (פונקציה למשל בולצמן) לפרופיל בעוצמה ממוצעת רדיאלי בשימוש נקודת פיתול שלו (הידוע גם בשם x 0) כהגדרה של R. מתאים 2-Photon microangiography (טקסס אדום) חשפה חתך של כלי דם בודד מרכזי במרכז הגליל. הקוטר של כלי הדם המרכזי ניתן ליישם ישירות על מנת לקבוע r. שני הפוטונים NADH מספק הדמיה ברזולוציה מרחבית כמו הדמיה ברזולוציה גבוהה בו זמנית של microangiography קליפת המוח. תכונה חשובה עבור היישום כמותית של שיטה זו הוא עמ &#39;50 של עלייה הקרינה NADH כבר נמדד להיות של 3.4 ± 0.6 מ&quot;מ כספית 1 וכי עוצמת הקרינה NADH כפונקציה של רקמות ת.ד. microregional 2 ניתן לתאר באופן מתמטי עם פונקציה sigmoidal. . אנו מראים כי טכניקה זו מאפשרת לזהות אזורים במוח שהם הפגיעים ביותר היפוקסיה (על ידי הפחתת תכולת החמצן באוויר כדי% 10). כמו כן, אנו מראים כי דיפוזיה חמצן כדלקמן דפוס פשוטה perivascular גיאומטרי. אחת קריטיתצעד iCal בשיטה זו הוא איכות הכנה חלון גולגולתי. הניתוח צריך לייצר פגיעה מינימאלית על מנת לא להפריע את זרימת הדם באזור חשוף. החשש הוא כי לקראת פגיעה בניתוח, קליפת המוח מתחת לחלון יכול להיות חוסר חמצן מלכתחילה, לא ניתן שום ניסויים משמעותיים. חלון מוכנה היטב גולגולתי צריך שלמות כלי הדם ראשיות ומשניות עם זרימת הדם חי בכל סוגי כלי ולא דימום משמעותי לאורך הקצוות. בתנאים normoxic (PaO2 80-100 מ&quot;מ כספית, Sp O2 97-99%) parenchyma המוח צריך להפגין הקרינה אחידה, NADH הומוגנית ללא כתמים בולטים, רקמות בהירים עם הקרינה NADH גבוהות. המגבלה הפיזית היסוד של הגישה שלנו היא מוגבלת חדירה לעומק. הקרינה כחול ירוק NADH במוח הוא נחלש במהירות על ידי ספיגת המוגלובין פיזור רקמת באורכי גל אלה. אפילו עם צמצם המספרי גבוהה (למשל 1.05) מיםמטרות טבילה שני הפוטונים NADH הדמיה מוגבל כיום קליפת המוח שכבות I ו-II. מגבלה זו היא רלוונטית מבחינה מדעית, כי חילוף החומרים של אנרגיה או בקרבת החומר הלבן צפויה שונים החומר האפור. עם זאת, החקירה של מבנים קורטיקליים עמוקים כגון שכבות IV-VI או מבנים קורטיקליים כמו שטחים החומר הלבן או הסטריאטום ידרוש את השימוש microlenses מיוחדים כמתואר vivo 6 ב קליפת העכבר. NADH מבוססת המדידה של גבולות דיפוזיה חמצן יכול להיות שימושי במיוחד בשילוב עם מדידות אחרות כגון ניתוח hyperemia פונקציונלי, וזיהוי של שיעורי השטף נימי 7. לדוגמה, טכניקה זו ניתן להתאים לדמיין היפוקסיה ב שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) מודלים. גיאומטריה פשוטה של ​​דיפוזיה חמצן מאפשר לחזות את צבע החמצן מיטות כלי הדם בנסיבות בהן צפיפות נימי הוא דהמקומט 8 (למשל, AD 9) ולבדוק אם רקמת המוח באזורים עם צפיפות נימי מופחת נמצאים בסיכון מוגבר לנזק היפוקסיה עקב microstrokes. היכולת התמונה microregionally גם מאפשר לבחון את הגיאומטריה ואת הגודל של microstrokes רקמות ולקבוע את עוצמת הקול של הרקמה שבה מתרחשת היפוקסיה, כמו גם את הקשר בין היפוקסיה רקמות ומוות עצבי לאחר שיפוץ או נימי 10. לבסוף, מאז עליית הקרינה NADH אנדוגני הם תוצאה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה חריפה, שיטה זו יוצרת הזדמנות להשתמש הדמיה NADH ככתב ספציפי לחילוף חומרים של אנרגיה עצבית 11 ו - Proxy עבור תפקוד המיטוכונדריה. לסיכום, שני פוטונים הדמיה של אנדוגני NADH הקרינה הוא כלי פשוט, תובעני, שניתן להשתמש בהם כדי להבין את העברת חמצן וצריכת במוח הן תחת נורמליובמדינות פתולוגיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr valign="top"><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> כריות חימום </td><td> מעבר חום Bodi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> משחת עיניים (דמעות מלאכותיות) </td><td> פייזר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone-יוד 10% הפתרון </td><td> בבטאדין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלוריד פתרון Ferric 10% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלט </td><td> Stoelting החברה </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II handpiece ערכת </td><td> פירסון </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 חתיכות מקדח </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5 </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5/45 </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 זכוכית coverslip </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> מכפיל צינור </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> טי: ספיר לייזר מאי טאי </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

היכולת של המוח לתפקד ברמות גבוהות של הדרישה המטבולית תלויה באספקת חמצן רציפה באמצעות זרימת דם וחמצן לרקמות דיפוזיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול הניסוי ומתודולוגיים דמיינו ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional ו להסיק הדרגתיים חמצן perivascular בקליפת העכבר. הוא מבוסס על מערכת היחסים הבלתי ליניארי בין dinucleotide nicotinamide אדנין (NADH) עוצמת הקרינה אנדוגני ולחץ חמצן חלקי הרקמה, שם נצפתה רקמה NADH הקרינה לפתע מגביר את רמות החמצן ברקמות מתחת 10 מ&quot;מ כספית 1. אנו משתמשים שני הפוטונים עירור ב 740 ננומטר המאפשר עירור זמנית של הקרינה NADH מהותי רקמות הפלזמה בדם בניגוד טקסס האדום dextran. יתרונותיה של שיטה זו על פני הגישות הקיימות כוללות: הוא מנצל את האות הרקמה הפנימית וניתן לבצעו באמצעות תקן 2 פוטון in vivo imהזדקנות ציוד, אלא מאפשר ניטור רציף בתחום שלם של נוף עם רזולוציה עומק של ~ 50 מיקרומטר. אנו מראים כי רקמת המוח באזורים המרוחקים מן כלי הדם המוחיים מתאימות באזורים הפגיעים קו פרשת המים אשר 1 להיות hypoxic תפקודית לאחר ירידה באספקת החמצן בכלי הדם. שיטה זו מאפשרת לאדם חמצון התמונה microregional קליפת המוח, ולכן הוא שימושי עבור בחינת התפקיד של אספקת מספיק חמצן לרקמות או מוגבל במחלות neurovascular ושבץ.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence at JoVE.com

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

כאן אנו מתארים את שיטת ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional של קליפת המוח העכבר<em&gt; In vivo</em&gt;. היא מבוססת על הדמיה של שני פוטונים בו זמנית של dinucleotide nicotinamide אדנין (NADH) ו microcirculation קליפת המוח. שיטה זו שימושית לצורך ניתוח ברזולוציה גבוהה של אספקת החמצן לרקמות.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K Views.  University of Rochester Medical Center. כאן אנו מתארים את שיטת ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional של קליפת המוח העכבר In vivo. היא מבוססת על הדמיה של שני פוטונים בו זמנית של dinucleotide nicotinamide אדנין (NADH) ו microcirculation קליפת המוח. שיטה זו שימושית לצורך ניתוח ברזולוציה גבוהה של אספקת החמצן לרקמות.

Video: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.