עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים NS052535 ל GAG ו EY014061 &amp; EY014997 כדי ARL, כמו גם פרס UL1DE019583-02 הקונסורציום.

כדי למנוע הטיה, הנסיין ביצוע הערכות לא צריך ידע של גנוטיפ של החיה. צעדים בודדים הבקיע בסולם של 0-3, כאשר 0 מייצג היעדר הפנוטיפ הרלוונטי 3 המייצג את הביטוי החמור ביותר. כל בדיקה מבוצעת מספר פעמים על מנת להבטיח כי התוצאה היא לשחזור. השמנה יסבך את הפרשנות של כל הצעדים המתוארים. החוקר מומלץ לשקול עכברים הבאים הבקיע פנוטיפ להעריך את התפקיד האפשרי של השמנה בתוצאות. Ledge מבחן המבחן אדן היא מדידה ישירה של תיאום, אשר נפגעת ataxias cerebellar ורבים הפרעות ניווניות אחרות. צעד זה הוא הכי דומה ישירות סימנים האדם של אטקסיה cerebellar. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העכבר מהכלוב ולשים אותו על המדף של הכלוב. עכברים יהיו בדרך כלל הליכה לאורך המעקה ולנסות לרדת בחזרה לתוך הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר כפי שהוא הולך לאורך המעקה הכלוב ומוריד את עצמו אל תוך הכלוב שלה. עכבר wild-type יהיה בדרך כלל הליכה לאורך המעקה מבלי לאבד את שיווי המשקל שלו, תפחית את עצמה בחזרה אל תוך הכלוב בחן, באמצעות כפותיו. זה מוקצה ציון של 0. אם העכבר מאבד את שיווי שלה תוך כדי הליכה לאורך המעקה, אבל חוץ מזה נראה מתואמת, הוא מקבל ציון של 1. אם זה לא יעיל להשתמש רגליו האחוריות, או נוחתת על ראשו ולא כפותיו כאשר יורד לתוך הכלוב, הוא מקבל ציון של 2. אם הוא נופל מאדן החלון, או כמעט כך, תוך כדי הליכה או לנסות להוריד את עצמו, או מניד ומסרב לזוז בכלל למרות העידוד, הוא מקבל ציון של 3. עכברים חלק ידרוש דחיפה קלה כדי לעודד אותם לצעוד לאורך המעקה או לרדת לתוך הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את הציון במבחן המדף. </li></ol> Hindlimb וספקה Hindlimb וספקה הוא סמן של התקדמות המחלה במספר מודלים העכבר של ניוון מוחיים, כולל ataxias cerebellar מסוימים [1]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הזנב סמוך לבסיס שלה להרים את העכבר ברורה של כל האובייקטים שמסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המיקום hindlimb למשך 10 שניות. אם hindlimbs באופן עקבי פשוקות החוצה, הרחק מן הבטן, הוא מקבל ציון של 0. אם אחד hindlimb הוא חזר לכיוון הבטן במשך יותר מ -50% מהזמן מושעה, הוא מקבל ציון של 1. אם שני hindlimbs הם חזר בו חלקית כלפי הבטן במשך יותר מ -50% מהזמן מושעה, הוא מקבל ציון של 2. אם hindlimbs שלה חזר בו לגמרי נוגע בבטן במשך יותר מ -50% מהזמן מושעה, הוא מקבל ציון של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר חזרה לכלוב שלה שיא הניקוד hindlimb שלה לופתות. </li></ol> הליכה הליכה היא מידה של תיאום תפקוד השרירים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העכבר מהכלוב והנח אותו על משטח ישר עם הראש שלה מול הרחק החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר מאחור כפי שהוא הולך. אם העכבר נע בדרך כלל, עם משקל הגוף שלה נתמך על כל הגפיים, עם הבטן שלה לא נוגעות בקרקע, ועם hindlimbs שני המשתתפים באופן שווה, הוא מקבל ציון של 0. אם זה מראה רעד או נראה צולע תוך כדי הליכה, הוא מקבל ציון של 1. אם זה מראה רעד קשה, צליעה קשה, הוריד האגן, רגליים או נקודת מהגוף בזמן תנועה (&quot;רגל ברווז&quot;), הוא מקבל ציון של 2. אם העכבר מתקשה לנוע קדימה וגורר הבטן שלה על פני הקרקע, הוא מקבל ציון של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר חזרה לכלוב שלה שיא הניקוד ההליכה שלה. </li></ol> עקום השדרה לאחור קיפוזיס היא עקמומיות הגב מאפיין של עמוד השדרה, כי היא ביטוי שכיח של מחלות ניווניות בעכברי מודל [2]. הוא נגרם על ידי אובדן של טונוס שרירים של שרירי עמוד השדרה משני ניוון מוחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העכבר מהכלוב והנח אותו על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את זה כמו שזה הולך. אם העכבר הוא מסוגל בקלות ליישר את עמוד השדרה שלה כפי שהיא הולכת, ואין קיפוזיס מתמיד, הוא מקבל ציון של 0. אם העכבר המוצגים קיפוזיס קלה אך הוא מסוגל ליישר את עמוד השדרה שלו, הוא מקבל ציון של 1. אם הוא אינו מסוגל ליישר את עמוד השדרה שלה לחלוטין ושומר קיפוזיס קלה אך מתמשכת, הוא מקבל ציון של 2. אם העכבר שומרת קיפוזיס מבוטא כפי שהוא הולך, או בזמן שהוא יושב, הוא מקבל ציון של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר חזרה לכלוב שלה שיא הניקוד קיפוזיס שלה. </li></ol> נציג תוצאות עם מספר מספיק של בעלי חיים, הליך זה הוא מסוגל לאתר הבדלים בין זני פנוטיפ ותוך מאמץ זהה לאורך זמן. לצורך ניתוח הנתונים, לחשב את הציון עבור כל מדד על ידי נטילתממוצע של שלוש מדידות של כל אדם. אמצעים ניתן לנתח בנפרד או לשלב ציון פנוטיפ מרוכבים עבור כל אדם. טבלת הנתונים וליישם את שיטות סטטיסטיות מתאימות כדי לקבוע משמעות. איור 1 מציג תוצאות הערכה פנוטיפ שילוב של מודל Murine SCA7 מהונדס. במודל floxed-SCA7-92Q זה מהונדס, הגן האנושי ataxin-7 עם 92 חזרות החטיבה מוקף אתרים loxP והביע מתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי. הציון המשולב כולל את הפנוטיפ וספקה, הליכה אדן, הילוך והערכות קיפוזיס עבור ציון מירבי של 12. פנוטיפ פרוגרסיבי SCA7 ב-floxed SCA7-92Q העכברים הטרנסגניים מודגם על ידי הגדלת ציון פנוטיפ מורכב, אשר עולה בקנה אחד עם האופי הפרוגרסיבי של המחלה האנושית. <img src="/files/ftp_upload/1787/1787fig1.jpg" alt="איור 1" /> . איור 1 Floxed-SCA7-92Q עכברים התערוכה פנוטיפ פרוגרסיבי SCA7 כי הוא שונה באופן משמעותי Non-טראנסגנטי להמלטה החל בשעה 20 שבועות (2-way ANOVA: Bonferroni פוסט הוק; *** p &lt;0.001). העכברים הוערכו על סולם 0-3 עבור כל מבחן אדן, לופתת, הליכה, ו קיפוזיס. הציון המשולב הממוצע עבור כל גנוטיפ בגיל זה היה מחושב. ברים מייצגים SEM.

<ol>
	<li>Chou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine-expanded+ataxin-3+causes+cerebellar+dysfunction+of+SCA3+transgenic+mice+by+inducing+transcriptional+dysregulation.">Polyglutamine-expanded ataxin-3 causes cerebellar dysfunction of SCA3 transgenic mice by inducing transcriptional dysregulation.</a> Neurobiol Dis. 31 (1), 89-101 (2008).</li><li>Thomas, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+endogenous+androgen+receptor+protein+accelerates+motor+neuron+degeneration+and+accentuates+androgen+insensitivity+in+a+mouse+model+of+X-linked+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Loss of endogenous androgen receptor protein accelerates motor neuron degeneration and accentuates androgen insensitivity in a mouse model of X-linked spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 15 (14), 2225-2238 (2006).</li><li>Ditzler, S., Stoeck, J., LeBlanc, M., Kooperberg, C., Hansen, S., Coppin, L., Olson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Neurobehavioral+Assessment+Reveals+that+FK506+Delays+Symptom+Onset+in+R6/2+Huntington's+Disease+Mice.">A Rapid Neurobehavioral Assessment Reveals that FK506 Delays Symptom Onset in R6/2 Huntington's Disease Mice.</a> Preclinica Research Articles. 1 (3), 115-126 (2003).</li></ol>

מחקרים אלה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים וושינגטון מוסדיים ועדת שימוש.

פרוטוקול זה נועד להיות הערכה רגיש ביצע בקלות של חומרת המחלה בעכברי מודל אטקסיה cerebellar. רכיבים בודדים של מערכת הניקוד יהיה פחות או יותר יעיל מודלים העכבר שונים של ניוון מוחיים. אלמנטים של מערכת זו מניה שימשו ביעילות להעריך מגוון של...

a simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia

אנו מתארים פרוטוקול עבור כימות מהיר ורגיש של חומרת המחלה בעכברי מודל cerebella אטקסיה. הוא נגזר הערכות שפורסמו בעבר פנוטיפ במודלים של מחלות שונות, כולל ataxias spinocerebellar, מחלת הנטינגטון של ניוון שרירים spinobulbar. אמצעים כגון גפיים אחוריות וספקה, מדף הבדיקה, הליכה ו קיפוזיס. למדוד כל נרשם בסולם של 0-3, עם סך משולב של 0-12 עבור כל ארבעת הצעדים. התוצאות ביעילות להפלות בין אנשים מושפעים ולא מושפעים, גם בעת לכימות התקדמות הזמני של פנוטיפים מחלת ניוון עצבי. אמצעי יכול להיות מנותח בנפרד או לשלב ציון פנוטיפ מרוכבים עבור כוח סטטיסטי רב יותר. השילוב האידיאלי של ארבעת הצעדים שתוארו יהיה תלוי ההפרעה הנדון. אנו מציגים דוגמה הפרוטוקול המשמש כדי להעריך את חומרת המחלה במודל עכבר מהונדס מסוג אטקסיה spinocerebellar 7 (SCA7). אלברט ר La Spada ואת גוון א גן תרמו כתב היד הזה שווה.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia at JoVE.com

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

אנו מתארים פרוטוקול עבור כימות מהיר ורגיש של חומרת המחלה בעכברי מודל אטקסיה cerebellar. אמצעים כגון גפיים אחוריות וספקה, מדף הבדיקה, הליכה ו קיפוזיס. פרוטוקול זה ביעילות מפלה בין אנשים מושפעים ולא מושפעים, ומזהה את ההתקדמות של אנשים מושפעים לאורך זמן.

ניקוד פשוט Composite הפנוטיפ מערכת להערכת מודלים של עכבר אטקסיה cerebellar

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

a-simple-composite-phenotype-scoring-system-for-evaluating-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.4K Views.  University of Washington. אנו מתארים פרוטוקול עבור כימות מהיר ורגיש של חומרת המחלה בעכברי מודל אטקסיה cerebellar. אמצעים כגון גפיים אחוריות וספקה, מדף הבדיקה, הליכה ו קיפוזיס. פרוטוקול זה ביעילות מפלה בין אנשים מושפעים ולא מושפעים, ומזהה את ההתקדמות של אנשים מושפעים לאורך זמן.

Video: A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

עכבר מודלים של לויקומלציה periventricular

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

שיטה כללית להערכת דגירה של השתוקקות סוכרוז בחולדות

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

מבחני חוש הריח למודלי עכבר של ניווניות מחלות

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor impairment that worsens with time. While considerable advances have been made in determining genetic drivers of ALS for a subset of patients, the majority of cases have an unknown etiology. Further, the mechanisms underlying motor neuron dysfunction and degeneration are not well understood; therefore, there is an ongoing need to develop and characterize representative models to study these processes. Caenorhabditis elegans can adapt their movement to the physical constraints of their surroundings, with two primary movement paradigms studied in a laboratory environment- crawling on a solid surface and swimming in liquid. These represent a complex interplay between sensation, motor neurons, and muscles. C. elegans models of ALS can exhibit impairment in one or both of these movement paradigms. This protocol describes two sensitive assays for evaluating motility in C. elegans: an optimized radial locomotion assay measuring crawling on a solid surface and an automated method for tracking and analyzing swimming in liquid (thrashing). In addition to the characterization of baseline motor impairment of ALS models, these assays can detect suppression or enhancement of the phenotypes from genetic or small molecule interventions. Thus, these methods have utility for studying ALS&#160;models and any C. elegans strain that exhibits altered motility.

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol describes two sensitive assays for discriminating among mild, moderate, and severe motor impairment in C. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis, with general utility for C. elegans strains, with altered motility.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...