אנו מודים לד&quot;ר שיר Yijun, וחברי Kuruvilla Hattar זאו תלת במעבדה של המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס עצה ועזרה. נתמך על ידי NIH מענקים DC007395 ו DC009946.

חלק 1. הגדרת הקלטה EOG מנגנון הקלטה מורכב אלקטרודה הקלטה, אלקטרודה השוואתית, משלוח צינור אוויר, שלב הדגימה, ואת מיקרוסקופ לנתח, כל מעוגן על שולחן האוויר בתוך כלוב פאראדיי. Micromanipulators משמשים מיקום האלקטרודות ואת צינור אספקת האוויר. זרם אוויר רציפה הוא מבעבע דרך מים מזוקקים כדי להוסיף לחות לפני עובר דרך צינור אספקת האוויר על הדגימה. צלחת תרבות 60 מ&quot;מ מלא Sylgard עד לעומק של 6-8 מ&quot;מ משמש כמשטח הרכבה הדגימה. גם ותעלה הם חלולים מתוך Sylgard בצלחת גובר לספק אמצעי לחבר את אלקטרודה חשמלית התייחסות הדגימה באמצעות פתרון שונה רינגר. אלקטרודה הקלטה האלקטרודה התייחסות מחוברים למגבר. אותות מן המגבר נשלחים digitizer, ולאחר מכן למחשב. תוכנות כגון Axograph או pClamp יכול לשמש כדי לשלוט על פרוטוקול גירוי, כדי להקליט את האות, עבור ניתוח בדיעבד של התגובות. אוסצילוסקופ מחובר אחרי המגבר יכול להיות נוח עבור ניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי תוך הצבת אלקטרודה הקלטה במהלך ההקלטות EOG. מסירה של גירויים odorant נשלטת על ידי Picospritzer, אשר מחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת אות. לחץ האוויר בכל Picospritzer מוגדר 10 psi. טנק באוויר הרגולטור יחיד יכול לשמש כדי לספק אוויר לשולחן הן האוויר Picospritzer. טנק באוויר הרגולטור השני משמש כדי לספק אוויר זרם האוויר humidified, כמו זה דורש לחץ נמוך כמות גדולה של זרימת האוויר. רק לפני מתן תמריץ odorant, הפלט Picospritzer מחובר בקבוק odorant. הבקבוק odorant מחובר אז צינור אספקת האוויר. חלק 2: הכנת אלקטרודות אלקטרודה ההקלטה חוט כסף chlorided בכוס משך נימי מלאים פתרון שונה של רינגר (135 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM CaCl 2, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.4, מסנן מעוקרים). אלקטרודה השוואתית הוא חוט כסף chlorided. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן חוט כסף לתוך מחזיק האלקטרודה. עבור האלקטרודה הקלטה, 1-2 ס&quot;מ של חוט צריך לבלוט מהקצה של מחזיק האלקטרודה. חוט נוסף ניתן עזב האלקטרודה התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף את המעיל AgCl על חוט כסף, מקם את חוט 0.1 M NaCl ולחבר את מחזיק האלקטרודה להדק החיובי של מקור מתח DC 1.5-9 וולט. הטרמינל השלילי של מקור הכוח צריך להיות מחובר חשמלית של פתרון 0.1 M NaCl. אפשר התגובה chloriding להמשיך במשך 10 דקות. כדי להשוות כל מטען סטטי בין ההקלטה לבין אלקטרודה השוואתית, לגעת בקצרה את האלקטרודות יחד לפני להתקין אותם במכשיר ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך זכוכית נימי באמצעות חולץ micropipette. פתיחת בקצה של נימי צריך להיות סביב 5-10 מיקרון קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עיפרון יהלום להבקיע ולשבור את הקצה הקהה של נימי כך ~ 2 ס&quot;מ יותר מאשר חוט כסף. Fire-ללטש את הקצוות עם הלפיד בוטאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים agarose 0.5% בפתרון שונה רינגר. משוך כמות קטנה של פתרון agarose מותכת לתוך קצה האלקטרודה בעזרת פיפטה ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את נימי משך כ 1 / 2 הדרך עם פתרון שונה של רינגר (מזרק כי כבר מחומם ומשך יש סוף דק וארוך הוא שימושי לצורך זה). בעדינות קפיצי נימי כדי לסלק בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה מלא בצנצנת אחסון עם כמות קטנה של פתרון שונה רינגר בתחתית עד שהם מוכנים לשמש. לאחר דגימת רקמה ערוכה ומוכנה הקלטה, להתקין נימי מלא על חוט האלקטרודה ההקלטה. </li></ol> חלק 3: פתרונות odorant הכנת אצטט odorants amyl ו heptaldehyde לעורר תגובות גדולים הם בחירה טובה וכך גם ממריצים EOG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב צינורות microcentrifuge, להכין סדרה של דילולים של odorant ב sulfoxide דימתיל (DMSO). כנקודת התחלה עבור עקומת מנה תגובה, להכין פי 10 דילולים מ M 5-5 x 10 -6 מ &#39; הפוך את דילולים טרי בכל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל את odorants של פי 50 על ידי ערבוב מים 100 מניות בדילול μL ב DMSO עם מים MLS 4.9 ב 2 בקבוקים עם פקקים לאונקיה סיליקון. בואו הפתרונות לאזן בבקבוקים למשך 30 דקות לפחות. שים לב כי ריכוז אדי של odorants בבקבוק אחד אינו ידוע, אך עשוי להשתנות כפונקציה של ריכוז odorants בשלב נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שני 18-מד מחטים באמצעות פקק סיליקון provide קלט פלט יציאות. יציאות צריך להיות מחובר לחשמל כאשר הבקבוק לא בשימוש. </li></ol> חלק 4: הקלטה וניתוח נתונים EOG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכבר ידי המתת חסד CO 2 או הרדמה יתר בעקבות עריפת ראש. הסר את העור שמעל הגולגולת sagittally לחצות את הראש לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחצית הראש, בצד המדיאלי למעלה, על צלחת גובר. הסר בזהירות את מחצה לחשוף את turbinates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת עם רקמה רכוב על הבמה את ההקלטה. יישר את הבמה כל כך את המיקום ההקלטה turbinates הוא מרוכז תחת המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הטנק באוויר כדי לספק אוויר humidified אל פני השטח חלזוני. מיקום צינור אספקת האוויר, כך הוא כ 10 מ&quot;מ מן המיקום ההקלטה. קצב הזרימה הוא ~ 600 mL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המגבר על מצב DC (הגברה AC יניעו חפצים האות EOG) עם פילטר נמוך לעבור על kHz 1, ולהשיג על 100x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקלטה אלקטרודות התייחסות על micromanipulators. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את האלקטרודה התייחסות אל תוך הבאר על צלחת הרכבה ומכסים פתרון כזה הוא מחובר חשמלית לרקמה שונה רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוריד את האלקטרודה הקלטה על פני השטח של חלזוני IIb או השלישי. האלקטרודה צריכה כמעט לגעת במשטח של אפיתל הריח! כאשר האלקטרודה בא במגע עם האפיתל (כלומר משלים מעגל חשמלי) בסיסית ישר יופיע האוסילוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף בקבוק odorant לנמל בצד על צינור אספקת האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, ליזום פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה לרכישת נתונים צריך להיות 2 קילוהרץ ומעלה. התוכנה תפעיל את הדופק ריח להתחיל את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול גירוי אופייני יכול להיות דופק 100 msec משך אחת, יחד 100 msec פולסים מופרדים על ידי רווח 1 שניות, או 10 שניות הדופק מתמשכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר קצת זמן בין פרוטוקולי כך את רקמת מותאם מינימלית. רגע אחד הוא די ריכוזי נוזלי של אצטט amyl ו heptaldehyde עד 10 מ -3: בריכוזים גבוהים לאפשר 5 דקות. לאחר מתן ריח בריכוזים גבוהים (כמו בסוף של עקומת מנה תגובה) ריח שיורית עשויים להישאר בצינור. לשטוף את צינור האוויר עם אתנול 95% ויבש לפני שתמשיך עם דגימות רקמה נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Axograph התוכנה מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של האות EOG. פרמטרים אלה כוללים את המשרעת בתגובה, חביון, זמן שיא, וקבועים זמן של סיום. זה יכול להיות רצוי דיגיטלית לסנן עקבות ב 25 הרץ לפני ניתוח נוסף. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. פרמטרים עבור EOG ניתוח. פרמטרים כמה EOG הם שימושיים במיוחד עבור השוואה של תגובות בין עכברים, לרבות משרעת בתגובה, חביון (הזמן בין הגירוי כאשר ניתנת ותגובה מתחיל), עלייה (הזמן בין תחילת התגובה ואת שיא), זמן שיא (הזמן מתחילת הגירוי לשיא של התגובה), וזמן קבוע סיום (τ, נקבע על ידי התאמת שלב הדעיכה של התגובה משוואה מעריכית יחיד ). לשם השוואה של פרמטרים קינטיים כגון חביון, זמן העלייה, זמן קבוע של סיום, רצוי לנרמל את המשרעת שיא של תגובות לפני ניתוח. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. נציג EOG אותות תחת פרוטוקולים גירוי שונים. (א) דוגמאות EOGs מתוך עכבר בתגובה לגירוי עם ריכוז גדל והולך של אצטט amyl. קו שחור בחלק העליון של הלוח מציין את העיתוי וזמן הגירוי odorant. הריכוזים במקרא הם ריכוזים של הפתרון נוזלי. (ב) ביחס מנה תגובה ממוצע של חמישה עכברים. ברים שגיאה הם רווחי סמך 95%. ירידה משרעת השיא הוא נצפה לעיתים קרובות ריח בריכוזים גבוהים מאוד. (ג) דוגמה EOG בתגובה לגירוי לזווג-דופק. הדופק קצר אחד של odorant מעורר הסתגלות שנמשך כמה שניות. (ד) דוגמה EOG בתגובה 10-sec גירוי מתמשך odorant. EOG מראה הפחתת רגישות במהלך המצגת odorant רציפה.

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li><li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2+-calmodulin-dependent+odor+adaptation.">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li><li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping.">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li><li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+marker+protein+(OMP)+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons.">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li><li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1.">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li><li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2+/CaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation.">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li><li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

העכברים טופלו ו מורדמים עם שיטות טיפול אושרה על ידי בעלי חיים ועדות השימוש של אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס.

עם ההתקנה המתואר בפרוטוקול זה, גירויים odorant על פני השטח של האפיתל הריח יהיה עקבי בין ההכנות רקמות, המאפשרות השוואה בין סוג בר עכברים שעברו מוטציה, למרות ריכוז odorant המדויק ואת הדינמיקה אינם ידועים. מספר גורמים, במיוחד את המיקום להקליט את קצב הזרימה של האוויר humidified, לגרום לשינויים EOG. יש להקפיד לרשום מעמדות דומה על חלזוני אותו כדי למזער וריאציה. זה יכול בקלות להיות מושגת על ידי בעקביות הקלטה מאותו צד של הראש ולשמור את טביעת הרגל של המיקרוסקופ, משלוח צינור ריח, ואת micromanipulators על שולחן האוויר ללא שינוי בין דגימות רקמה. בנוסף, דגימות רקמה יש להציב מיד לתוך זרם אוויר humidified לאחר לנתיחה כדי למנוע ייבוש יתר של הרקמה. הקלטות EOG על עכברים יכולים גם להתבצע עם מנגנון זלוף נוזלי על העכבר מוכן turbinates 7, 14, 15, או על ידי השארת ראש שלם החדרת אלקטרודה לתוך קדח חור קטן מעל turbinates 16, 17. כל וריאציה של הקלטה EOG יש עוצמות משלה: אוויר שלב ההקלטות על ההכנות רקמות כמתואר בפרוטוקול זה דורשת כמות מזערית של ההתקנה הם הקלים ביותר לנהל, הקלטות באמצעות מנגנון זלוף נוזלי להקל על השימוש ריאגנטים תרופתי, למרות אופי הידרופובי של odorants רבים מסבך משלוח ריח, ולבסוף, הקלטות שבהן ראש נותר בשלמותו ניתן להשתמש ב &#39;מלאכותי לרחרח &quot;ניסויים, למרות מיקום האלקטרודה קשה יותר כאשר turbinates נחשפים במלואם.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

בעלי חיים תלויים olfaction להתנהגויות קריטיים רבים, כמו מציאת מקורות מזון, הימנעות מטורפים, וזיהוי conspecifics עבור הזדווגות ואינטראקציות חברתיות אחרות. ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא שיטה אינפורמטיבי, קל לנהל, ואמין לתפקד assay הריח ברמה של אפיתל הריח. מאז 1956 תיאור של EOG על ידי Ottoson ב צפרדעים 1, ההקלטה EOG יושם חוליות רבים, כולל סלמנדרות, ארנבות, חולדות, עכברים ובני אדם (נבדקה על ידי סקוט סקוט ג&#39;ונסון, 2002, נ&quot;צ. 2). ההתקדמות שינוי גנטי בעכברים לעורר עניין מחדש ההקלטה EOG לאפיון פיזיולוגיים של תפקוד חוש הריח של עקום החוצה עקום בעכברים. הקלטות EOG יושמו בהצלחה כדי להדגים את התפקיד המרכזי של חוש הריח התמרה רכיבים אות 3-8, ולאחרונה לאפיין את התרומה של מנגנוני ויסות מסוים לתגובות OSN 9-12. איתור odorant מתרחשת על פני השטח של האפיתל על חוש הריח cilia של OSNs, שם מפל הולכת אותות מוביל הפתיחה של תעלות יונים, יצירת זרם זורם לתוך cilia ו depolarizes הממברנה 13. EOG הוא פוטנציאל שלילי נרשם extracellularly על גירוי odorant על ​​פני השטח של האפיתל חוש הריח, הנובע סיכום של שינויים אפשריים שנגרמו OSNs תגובה הפרט בתחום הקלטה 2. השוואה של משרעת ו קינטיקה של EOG ובכך לספק מידע חשוב על איך הנדסה גנטית ומניפולציות ניסיוניים אחרים להשפיע על איתות המולקולריים שבבסיס התגובה OSN לריח. כאן אנו מתארים הקלטה אוויר EOG על שלב ההכנה של turbinates עכבר חוש הריח. בקצרה, לאחר להקריב את העכבר, turbinates חוש הריח נחשפים על ידי שחצתה את הראש לאורך קו האמצע והסרת מחצה. הכנה חלזוני ממוקם אז הגדרת הקלטה, אלקטרודה ההקלטה ממוקם על פני השטח של האפיתל חוש הריח על אחד turbinates המדיאלי. אלקטרודה הפניה מחובר חשמלית לרקמה באמצעות פתרון חיץ. זרם מתמיד של אוויר humidified הוא פוצץ על פני השטח של האפיתל כדי לשמור אותו לח. אדי פתרונות odorant הוא ניפח לתוך זרם של אוויר humidified כדי לעורר את האפיתל. התגובות מוקלטים דיגיטציה לניתוח נוסף.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording at JoVE.com

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K Views.  Johns Hopkins University. ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

Video: Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

שימוש יחיד Sensillum הקלטה לזיהוי תגובות חוש הריח Neuron של באגס במיטה לSemiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...