מחקר זה נתמך על ידי NIH DC052256 ו DC006015, ו-NSF 0324769 עד QG ו-T32 DC008072 ל BS.

1. הכנה הליך זה biosafety ברמה 2, לכן כל ההכנות הבאים עשויים במנדף Biohazard שבו נוהל microinjection מבוצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מחממים 37 ° C מיטת מים: מילוי שקית אחסון מפלסטיק עם מים - חותם ולהגדיר על חימום רוקנה לחסום חממה. זה יאפשר עכברים להתאושש הזרקת הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי מיכל פסולת Biohazard עם אקונומיקה 10% בנפח מתאים לטבילה של פסולת מתוך כל התהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת לפתוח קטנה של אתנול 70% ו צלחת שנייה עם ddH2O מעוקרים מקום בארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מזרק קיבולת 5μL המילטון עם מחט 33-מד ידי ריסוס מטה את הגוף ואת המחט עם 70% אתנול עם הבוכנה שלף כל הדרך. שוב ושוב לשאוב אתנול מן הצלחת להוציא אותו ואת כל הדרך לפחות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המחסנית על ידי מזרק מים סטריליים aspirating ולהוציא לפחות 5 פעמים. המקום מזרק בבטחה בצד בשכונה תרבות ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מניות ויראלי מ -80 ° C אחסון במקפיא ומניחים על קרח על מנת לאפשר הפשרה. Microinjection דורש 2μL המניות וירוס לכל העכבר titre של 10 יחידות מדבק 9 / mL. Lentiviruses ניתן להשיג ממקורות מסחריים או המיוצרים במעבדה לפי הפרוטוקול הוקמה (לויס et al., 2002). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לשלב הזרקת המספק שטח מוגבה מעל פני השטח את מכסה המנוע - יכול להשתמש תרבות 10 ס&quot;מ צלחת מכוסה בסדין של Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר מגבונים אלכוהול ליד תחנת ההזרקה. </li></ol> 2. Microinjection של חלקיקים לתוך lentiviral אפיתל ההרחה הנהלים כל חיה שבוצעה בשיטה זו נעשים בהתאם להנחיות שאושרו IACUC. המתח מ.א.ס. מאסכאלאס C57BL/6J המודל בעלי חיים המשמשים כל הניסויים הדגימו כאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הגורים העכבר על ידי היפותרמיה ידי לקיחת עכבר גור (P0-P3) מתוך הכלוב לשים את הגור על כפפה חתך פתוח על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה הגור להיות בהרדמה מלאה, 2μL לשאוב מניות נגיפי לתוך המזרק המילטון מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על גבי הגור בשלב ההזרקה. משוך בעדינות עור מן החלק העליון של הראש ליד האוזן לכיוון החלק העליון של הצוואר. זה אמור לספק משטח העור לימד על חלל האף וגם יקל ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף על 3mm מתחת לפני השטח של העור כדי להגיע אפיתל ההרחה. Microinject 0.5μL של פתרון וירוס לכל זריקה, בוחרים בשני אתרים לכל צד, הן על ימין ועל שמאל (ארבע זריקות בסך הכל לכל עכבר = 2μL של הנגיף הצורך). אתרי הזרקה יש כשל בנפרד אחד מהשני. עבור המיקוד של אתרי הזרקה נכונה, החיפוש פני הגולגולת הגב על קווי המתאר של הנורה חוש הריח. קו זה גלוי בקושי בלידה דרך העור שקופה למחצה לבין הגולגולת. כדי להפוך את שתי זריקות לכל צד, מטרת זריקה אחת מקורי רק להתוות נורה אחת על ציר המדיאלי. הפוך את הכניסה second לרוחב להתוות את הנורה, אך הקפד זווית זריקה מדיאלית, כך שאתה יכול להגיע אפיתל הריח שנמצא מתחת ventrally הנורה. הימנע חודר את הנורה חוש הריח! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם יבש כל פתרון וירוס שיורית או דם עלול להימלט מן הזריקה או פתחי הנחיריים באמצעות Kimwipe. מיד להיפטר Kimwipes את מיכל נוזל אקונומיקה מדוללת Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מוזרק על מיטת מים בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1-4 עבור כל העכברים להיות מוזרק, נזכר תצטרך 2μL על מניות וירוס לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו עכברים להתאושש על החממה מיטת מים במשך 30 דקות לפני החזרה להם כלוב קינון המקורי שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הבמה microinjection, מגבונים sanitizing ואת כל נייר מוצרים נוספים ניקוי לרשות נוזל אקונומיקה Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק המילטון על ידי שאיפה חוזרות פליטה של ​​אתנול ואז מים כפי שנעשה בשלבים הכנה. אפשר המזרק לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת יעילות מקסימלית התמרה לחזור על הליך זה שוב 4 שעות. OSNs נגועים ניתן דמיינו בכל אורך של התא כמה כמו שלושה ימים. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה של צף סעיפים הנורה חוש הריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכבר מוזרק בנקודת הזמן הרצוי זלוף לתקן את הרקמה עם paraformaldehyde 4%. לנתח את OB. מדגירים את paraformaldehyde הלילה ואז סוכרוז 30% PBS לילה. שבץ בינוני הטבעה אוקטובר על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העטרה סעיפים OB מתקבלים על 60μm עובי באמצעות cryostat. טאטא סעיפים הנורה לתוך צלחת 10 ס&quot;מ תרבות עם 5 מ&quot;ל 1x PBS (pH 7.4). מדורים צריכים להיות כל הזמן צף PBS לאפשר אוקטובר עד דissolve. העברת חלקים צפים PBS לתוך בקבוקון 50 מ&quot;ל קונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להסתפק בסעיפים לחלק התחתון של המכל. אבק את PBS בלי להתחנף כל הסעיפים. לשטוף חלקים עם רקמה PBS 20mL. חזור ליישב צעדים אבק. רקמה Resuspend עם 10 מ&quot;ל PBS וחתכים העברת צף חרוטי בקבוקון 15 מ&quot;ל עבור immunostaining. לאחר סעיפים רקמות התיישבו, האבק PBS supernatant מבלי להפריע רקמות. סעיפים Resuspend עם 0.3% טריטון X-100 ב 1x PBS, pH 7.4 (PBS-Tx) המאפשר ניקוי כדי לנקב קרום התא. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אבק את supernatant ו הדגירה לחזור עם PBS-Tx פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים רקמות 10 מ&quot;ל של תמיסת חסימה (נסיוב סוס 5% PBS-Tx) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פתרון חסימת לפחות פעמיים עם PBS-Tx במשך 15 דקות כל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2ml של פתרון הנוגדן העיקרי PBS-TX. ראה ריאגנטים בסעיף ציוד נוגדנים השתמשו בניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף לשטוף second PBS-Tx חסימת פתרון נוגדן ראשוני. לדגור על פלטפורמה מתנדנדת לאט (~ 30rpm) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות כדי להבטיח חדירה מעמיקה לתוך בסעיפים צף 60μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לאחזר בזהירות בעזרת פיפטה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש חוזר עוד פעמיים בתוך שבועיים ללא אובדן משמעותי של עוצמת מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין (~ 30rpm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2ml של דילול נוגדנים משני PBS-TX. אבק מעל לשטוף האחרון ולהוסיף פתרון נוגדנים משני סעיפים רקמות. לעטוף את החלק החיצוני של הבקבוקון מכתים בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור, אשר יכול לגרום photobleaching fluorophore. המקום עטוף הבקבוקון על פלטפורמה לאט הנדנדה דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פתרון נוגדנים משני על ידי שאיבת אבק משם. לשטוף חלקים פעם עם PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. לשטוף פעמיים נוספות עם PBS (pH 7.4) במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. הר בסעיפים רקמה צבעונית על גבי שקופיות הזכוכית באמצעות Fluoromount G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך באמצעות סעיפים מוכתם עבור אקסונים OSN נגוע חיובי טרמיני האקסון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות תצוגה תלת מימדי של התווית OSN האקסון ואת מסוף ארבור, ליצור סדרה של קטעים אופטי דרך עומק 60μm של הפרוסה היעד רקמות OB (לאורך ציר z) באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית זו של Z-סעיף תמונות יכול להיות מוקרן יחד לאחר מכן לשחזר פרספקטיבה 360 מעלות של סיבוב אחד שכותרתו OSN האקסון, כולל פירוט סוכת מסוף בשלמותה. זווית סיבוב אחד כל אחד יכול ליפול בפח ו מיוצא כקובץ תמונה (כלומר, JPG, TIFF) עבור מצגת בפורמט 2D. </li></ol> 4. נציג תוצאות בעזרת השיטות שתוארו כאן, אנו יכולים transduce עצב סנסורי על ידי חוש הריח lentivirus in vivo. יש לנו אפוא OSNs נגוע דמיינו רחוק עם GFP וכתבים mCherry ניאון, כמו גם עם חלבון myc-tagged היתוך דרך immunocytochemistry. טכניקה זו מספקת שפע של OSNs נגועים. ובכל זאת, התמרה מתרחשת לסירוגין מספיק כדי לספק OSNs שכותרתו בנפרד, ובכך מאפשר לניתוח מורפולוגיה תא בודד. אקסונים מסופי האקסון הם צילמו בתוך קטעי רקמה OB בתוך סביבה מולדתם על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 1). כל OSN האקסון מסוף סוכת יכול בדרך כלל להיות שבוי בתוך סעיף 40-50μm אופטי. הגדלה גבוהה של נגוע מסופי האקסון OSN מאפשר ניתוח מפורט של מורפולוגיה סוכת axonal בשכבת גלומרולרי. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> באיור 1. מסלולו של נוירון יחיד חושי הריח האקסון ואת מסוף סוכת שלה.) קטע העטרה של הנורה חוש הריח של העכבר P7 מראה את שכבת עצב ההרחה (ONL) immunostained עבור OMP (אדום) ואת השכבה גלומרולרי (GL) immunostained עם שני OMP ו Vglut2 (אפור). האקסון יחיד הריח נוירון חושי להביע GFP (ירוק) עובר בתוך ONL וחודר לתוך המבנה גלומרולרי. ב) מסוף האקסון מורפולוגיה סוכת בתוך glomerulus המסומן בבירור על ידי ביטוי של GFP. Vglut2 שיתוף מכתים באפור מאירה את אזור glomular הכולל שבתוכו ה-GFP חיובי האקסון מרחיב abor סופנית. ג) OSNs נגוע lentiviral להביע GFP (ירוק) ב OE. Cytostructure של אפיתל הריח מוצג עם מכתים DAPI (כחול). ביטוי של GFP מאפשר הדמיה של גופים OSN התא תהליכים תאיים שלהם OE. ד) האקסון OSN ומורפולוגיה מסוף עם הביטוי Rap1GAP2 עקום על ידי shRNA. Lentiviruses נושא קלטת ביטוי כפול עם Rap1GAP2 shRNA תחת מקדם את העכבר U6 ו-GFP תחתהאמרגן CMV יושמו OE. אינפקטד מסופי האקסון הריח הציג מסוף סוכת פשוטה יותר בהשוואה לזו של פקד ה-GFP בלבד. בר = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

פרוטוקול זה הוא ביו בטיחות ברמה 2 תואם. כל אמצעי הבלימה סביבת עבודה מתאימה, הגנה אישית, נגיפי פסולת הוקמו בהתאם. הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם להנחיות IACUC.

Microinjection תוצאות lentivirus בהעברת קבע בונה גנים לתוך הדנ&quot;א הגנומי OSN. גישה זו מאפשרת לנו לבצע מניפולציות לטווח קצר או לטווח ארוך של גנים מועמדים באמצעות overexpression או בתיווך shRNA עקום למטה. בנוסף, אנו יכולים fluorescently תווית OSNs יחיד בקו הקיים עכבר מהונדס לקיים שיתוף לוקליזציה של אוכלוסיות קולטן odorant. Microinjection נדרשת התמרה lentiviral של OSNs. יש לנו ניסיון הסמקה ההשעיה lentivirus לתוך חלל האף אל transduce OSNs ללא הצלחה. לפיכך, אנו מבצעים microinjections דרך פני האף הגב על מנת לספק וירוס לשכבות הפנימיות של OE שבו גופים OSN תא שקר. ישנם יתרונות רבים לשימוש lentivirus על מניפולציה adenoviral הוקמה. התמרה Lentivral משתלב בגנום המאפשר מחקרים ארוכי טווח, בעוד adenovirus נותן רק transfection חולף עם timecourse מוגבל של מניפולציה גן (Doi et al. 2005). זיהינו lentivirally transduced OSNs עוד שלושה חודשים לאחר microinjection. תוחלת החיים של OSNs במכרסמים מבוגר הוא בדרך כלל בין 1-3 חודשים. OSNs נגוע lentiviral כך ניתן דמיינו את רוב חייהם, המאפשר חקירה של צמיחה האקסון OSN, היווצרות תחזוקה הסינפטי ו, כמו גם odorant-מגורה תגובות תהליך מחזור. בנוסף, lentiviruses יכולים להדביק ובתאים וכן ולאפשר להדמיה של OSNs עבור תקופות זמן ארוכות יותר. Adenovirus בקלות transduces OSNs כאשר החדיר לתוך חלל האף (זאו et al. 1996). עם זאת, זיהום adenoviral לעתים קרובות נפוצה מנקודת החשיפה, ואינה תשואה מבודד transductions תא בודד כמו אמינה כמו lentivirus. Lentiviral בתיווך מניפולציה גנטית OSNs ולכן טכניקה חזק ויעיל אפיון של תפקוד גנים OSNs יחיד in vivo.

Microinjection: עכברים יילוד היו microinjected באמצעות מזרק 5μL המילטון (Hamilton # 7647-01) מצויד במחט 33 מד (המילטון # 7762-06). Immunocytochemistry ריאגנטים: נוגדנים ראשי: נוגדן polyclonal ארנב GFP (בדיקות מולקולריות # A-6455), נוגדנים נגד עוף polyclonal OMP (מותאם אישית) (חן et al, 2005.) גיניאה חזיר polyclonal נוגדנים נגד VGlut2 (Millipore # AB2251). נוגדנים משני: Cy2-מצומדות חמור נגד ארנב (ג&#39;קסון Immunolab # 711-225-152), Cy3-מצומדות החמור נגד עוף (ג&#39;קסון Immunolab # 703-165-155) ו-Cy5 מצומדות נגד ניסיונות עז חזיר (ג&#39;קסון Immunolab # 106-175-008). מדורים היו רכוב על שקופיות הזכוכית עם Fluoromount G (דרום ביוטק # 0010-01) עם פתרון 50ng/mL הכרומטין DAPI הכתם. Confocal הדמיה: Z-ערימת התמונות צולמו באמצעות אולימפוס Flouview FV1000 מיקרוסקופ confocal ותמונות נאסף ומעובד על תחזיות 3D באמצעות אולימפוס FV10-ASW רכישת 2.01 confocal ותוכנה ניתוח.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

פיתוח מעגל חוש הריח המדויק מסתמך על תחזית מדויקת של חושי הריח נוירון (OSN) אקסונים מטרות הסינפטי שלהם הנורה חוש הריח (OB). מנגנונים מולקולריים של צמיחה האקסון OSN ומיקוד אינם מובנים היטב. ביטוי גנים מניפולציה ובעקבות חזותי של אקסונים OSN יחיד מסוף סוכת המורפולוגיה שלהם עד כה מאתגר. כדי לחקור תפקוד גנים ברמת תא בודד בתוך מסגרת הזמן המצוין, פיתחנו טכניקה המבוססת lentiviral לתפעל ביטוי גנים OSNs in vivo. חלקיקים lentiviral מועברות על ידי OSNs microinjection לתוך אפיתל ההרחה (OE). קלטות הביטוי אז הם משולבים באופן קבוע לתוך הגנום של OSNs transduced. חלבון הפלואורסצנט הירוק ביטוי מזהה OSNs נגוע מתאר מורפולוגיה כולו שלהם, כולל מסוף האקסון ארבור. בשל זמן אספקה ​​קצר בין microinjection זיהוי כתב, תפקוד לימודי הגן יכול להיות ממוקד בתוך פרק זמן צר מאוד של פיתוח. באמצעות שיטה זו, יש לנו לזהות ביטוי של GFP בתוך כמה כמו שלושה ימים עוד שלושה חודשים לאחר ההזרקה. השגנו גם יתר ביטוי shRNA בתיווך עקום על ידי microinjection lentiviral. שיטה זו מספקת מורפולוגיות מפורט של גופים OSN התא אקסונים ברמת תא בודד in vivo, ובכך מאפשר אפיון של פונקציה מועמד גנים במהלך התפתחות חוש הריח.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K Views.  University of California, Davis. אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה In vivo.

Video: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.