This work was supported by NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund, and RPB grants.

הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה וויין סטייט. 1. הכנת פתרון ניסויי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לנתח 1 יום 1 בשבוע שלפני הניסוי בפועל. השתמש בפתרון חיץ HEPES לנתיחה רשתית בגלל יכולת החציצה החזקה שלה בטמפרטורות נמוכות יותר 16. מערבבים את כל החומרים הכימיים כדלקמן (מ&quot;מ): 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.0 MgCl 2, 10 HEPES, גלוקוז 28. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. שמור את הפתרון במקרר עד השבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ההקלטה הוא המדיום &#39;איימס, שהוא נוזל מוחי מלאכותי השדרה (aCSF) המיועד להכנות רשתית 17. מהיום ליום של הניסוי, לשקול את האבקה &quot;איימס (4.4 גר &#39;לפתרון 500 מיליליטר) בצינור. כמו כן, לשקול את NaHCO 3 (0.95 גר &#39;ל -500 מיליליטר פתרון) ומערבבים עםהאבקה &#39;mes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון פיפטה תאית עבור הקלטות מהדק תיקון מהיום ליום של הניסוי. מערבבים את כל החומרים הכימיים כדלקמן (מ&quot;מ): 111 K-גלוקונאט, 1.0 CaCl 2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl 2, 5 ATP-Mg, ו1.0 GTP-Na. התאם ל- pH 7.2 עם KOH. סנן את פתרון פיפטה עם מסנן מזרק קונבנציונלי. הפוך ~ 500 aliquots μl ולאחסן אותם במקפיא או במקפיא עמוק. </li></ol> 2. הכנה ליום של ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה שלפני הניסוי, למקם את עכבר בכלוב (C57BL / 6J או רקע דומה, 4-8 שבועות, זכר) בחלל חשוך לO / N הסתגלות כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לנתיחה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא לנתח פתרון (100 - 200 מיליליטר) בכוס זכוכית, מניח אותו על קרח, ואת הבועה עם חמצן במשך לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל חמצון של התיבה הכהה לאחסון הכנת רשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן coverslips פלסטיק עם פסי שומן מחדשהכנות פרוסה tinal ולמקם כל אחד מהם בצלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סכין גילוח חדש למסוק (מבצעה רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך קרום מסנן לשני חצאים. זה מיועד לחיתוך ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הכלים לנתח וטפטפות העברה ליד מיקרוסקופ לנתח. אזור העבודה חייב להיות מאורגן היטב, כך שכל כלי ניתן לגשת בקלות בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להקלטות מהדק תיקון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר האבקה &#39;איימס וNaHCO 3 במים מזוקקים (איימס 4.4 g וNaHCO 3 0.95g / 500 מיליליטר DDH 2 O). בינוני הבועה &#39;איימס מעורב חמצן (O 95% CO 2 ו- 5% 2) לפחות 30 דקות בזמן חימום לרמת טמפרטורת הקלטה (~ 35 ° C). התאם את ה- pH 7.4 עם NaHCO 3 ועדיין מבעבעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את פתרון פיפטה הפנימי במהלך הניתוח. לאחר שהפשיר, להוסיף 0.01% sulforhodamine B עבור מכתים תאיים. </li></ol></li></ol> 3. הרשתית Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר חשוך, להרדים את העכבר באמצעות פחמן דו חמצני וחזה אוויר דו-צדדי. לאחר 2-3 דקות של שימוש בפחמן דו חמצני, העכבר יאבד את הכרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סמן העכבר כבר לא מגיב לקמצוץ זנב, enucleate במהירות את העיניים ומניחים אותם בפתרון לנתח קר בצלחת פלסטיק. בצע את pneumothorax דו-צדדי, כדי להבטיח את מותו של בעל החיים. מהירות לאחסן את העיניים בצלחת בתיבה הכהה. השתמש בצופת אינפרא אדום לנהל את ההליך בחושך. הערה: לחלופין, isoflurane, עריפת ראש, או נקע בצוואר הרחם יכולה לשמש להמתת חסד. השיטה של ​​המתת חסד צריכה לעקוב אחר ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ו / או ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר חשוך, להתאים את מיקרוסקופ לנתח ותאורת אינפרא אדום. מתחת למיקרוסקופ, להעביר עין מהמנה שלה לתוך צלחת פלסטיק 10 סנטימטרים wה- i הפתרון לנתח המקורר. ברציפות חמצן בועה דרך צינורות שהונח על החלק התחתון של צלחת הפלסטיק. התאם את נפח הזרימה כך שזה לא נמוך מדי, אבל לוודא שהוא לא גבוה מספיק כדי להפריע לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרנית ועדשת ההסרה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בחלק העליון של הקרנית עם סכין מיקרו-כירורגית. מחזיק את עצב הראייה בקצה השני של גלגל העין מונע את העין לנוע. להאריך את החתך באמצעות מספריים כירורגית. חותך את הקרנית עם כמה לובן העין סביבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את העדשה עם מלקחיים עדינים ולשלוף את העדשה באיטיות. אם הזגוגית דביקה מדי כדי להסיר את העדשה, לחתוך את הזגוגית עם זוג מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעיני הכוס הוא עשה, בעדינות לשפוך פתרון קר, חומץ לנתח לעיינית עם טפטפת העברה קטן. הערה: גלגל העין מתפחסת במהירות לאחר מבצעים חתך בקרנית. חשוב לשמור על הצורה של עין כעיוות עין במהלך פרו זהcedure יפגע הרשתית ולגרום להיפרדות רשתית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי הצדדים גב וגחון של הרשתית: הערה: בגלל חלוקה לא שווה של ירוק והסגול (UV) קונוסים 18, זיהוי אזור ברשתית ספציפי חשוב להקלטות תגובת אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הקו הולך על פני כוס עין הרשתית עוברת ליד ראש עצב הראייה. קו זה עובר ברובו מעבר לצד הגחוני של עצב הראייה; הצד כולל את עצב הראייה הוא צד הגב, ואילו השני הוא הגחון 19. ראה אתר זה בבירור תחת צופים אינפרא אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצורך הניסוי, לעשות חתך בצד המיותר. זה יהיה שימושי לאחר שבודד הרשתית מכוס עין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת זגוגית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, דגירה עין-הכוס עם hyaluronidase (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית עם מלקחיים נוספים-בסדר. הזגוגית היא בעיקרמצורף בתחתית והקצה החיצוני של העין-הכוס. בעדינות להסיר אותו בלי לגעת או דוקרים את הרשתית. כזגוגית עשויה להיות קשורה באופן הדוק לעיינית, להסיר בעדינות כדי למנוע היפרדות רשתית מהעין-הכוס. תמשיך למשוך עד אין מתח מורגש. הערה: שלב זה הוא חשוב במיוחד עבור לנתח רשתית העכבר; עם זאת, זה לא בעיה עבור הרשתיות של מינים אחרים כגון עכברים או סלמנדרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הרשתית מהעין-הכוס. תפוס את לובן העין ובעדינות לקלף את הרשתית באמצעות הישבן של מלקחיים. הערה: Whole-Mount הכנות רשתית יכולה להיות עשויה מהרשתית המבודדת. הפוך 03:57 קיצוצים בקצוות ולשטח את הרשתית, או לחתוך את הרשתית למספר חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הרשתית וזורקים את המחצית המיותרת של הרשתית (שלב 3.5). באותה צלחת פלסטיק, לחתוך את הרשתית שנותרה לשני חלקים. לכל פיסה של הרשתית, לחתוך את הקצוות כדי להפוך אתלוח רשתית, וחתוך את הקצוות מתקפלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את לוח רשתית על צלחת זכוכית בעזרת פיפטה גדולה העברה (~ 2 מיליליטר). להתחנף הפתרון העודף עם טפטפת קטן, להשתמש בפיסת נייר סינון כדי לשטח את הלוח, ולאחר מכן למקם במהירות חתיכת קרום המסנן על גבי הרקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה קטנה, במקום ירידה של ביתור פתרון בקרום המסנן. חכה ~ 15 שניות עד הפתרון משתרע על פני הקרום. במהלך תקופה זו, רקמת הרשתית תדבק קרום המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים פתרון לנתח קר יותר מתחת ומסביב למסנן. רקמת הרשתית עם קרום המסנן תצוף. תפוס את הקרום המסנן עם מלקחיים ומניח אותו בתא החיתוך. יוצקים לנתח פתרון על הרקמה, ולאחסן את ההכנה בתיבה הכהה. הערה: ההליך המתואר כאן הוא קריטי. חשוב לבצע את הפעולות הבאות במהירות על מנת להבטיח כי מקלות רקמת רשתית לmem המסנן<html> brane ולא להתייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מסוק, לחתוך את רקמת הרשתית לפרוסות. סביב 200 מיקרומטר עובי אפשרי ללימודי מהדק תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip פלסטיק עם פסי שומן בתא החיתוך. העבר את פרוסת רשתית על גבי מסילות השומן על coverslip פלסטיק. סובב את הפרוסה 90 מעלות כך שהסעיף הרוחבי גלוי. לחץ על קרום המסנן כלפי מטה על coverslip, אז, לכסות את הצדדים של נייר הסינון עם גריז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי פרוסה היא משותקת על coverslip פלסטיק, לתפוס את coverslip ולהעביר אותו לצלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ. יוצקים פתרון לנתח קר על הכנת הרשתית ולהטביע את ההכנה. אחסן כל מנה בתיבה הכהה, שאמור להיות מחומצן ברציפות. הערה: כל ההליך צריך להיעשות בזהירות, כדי שקרום הסינון אינו מעוות. אחרת, פרוסת הרשתית בקלות מפרידה מן קרום המסנן. </li></ol></li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. הצמד תיקון הקלטות מרשתית Slice הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש צינורות זלוף עם המדיום &#39;איימס. לאפשר לכל הבועות כדי לעבור בעת מילוי צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך טפטפות הקלטת מהדק תיקון עם חולץ. כדי למלא את פיפטה עם פתרון פיפטה, לטבול בישבן של פיפטה דקות 1 עד קצה פיפטה backfilled. בשלב הבא, למלא ~ 1/3 של פיפטה באמצעות מילוי מיקרו-פיפטה. אחסן כל פיפטה בתיבת פיפטה לחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הציוד להקלטות מהדק תיקון; כולל מחשב, מגבר, מצלמת CCD, ומיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את האור בחדר. הנח הכנת פרוסה רשתית על תא הבמה מיקרוסקופ באמצעות צופה אינפרא אדום. אחרי זה הוא משותק, להתחיל זלוף הרציף. הגדר את טמפרטורת זלוף ב33-37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את פני השטח הפרוסה עם מצלמת CCD. להתמקד במיקום היעד שבו ce היעדסוגי ll מתגוררים. בחר תא בריא למראה להקלטת מהדק תיקון (כלומר, זה צריך להיות משטח מראה חלק וצורת תא טובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיפטה הקלטה במחזיק פיפטה. לקדם את פיפטה להכנת פרוסה. כשהיא קרובה להכנת פרוסה (~ 2 מ&quot;מ מעל), למצוא את הקצה של פיפטה עם מיקרוסקופ. ברגע שקצה פיפטה גלוי מתחת למיקרוסקופ, להזיז את הקצה מטה לכיוון תא המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המגבר. התאם את פיפטה ב0 mV / 0 הרשות הפלסטינית (איפוס) ולהתחיל דופק חשמלי רציף של ~ 5 mV ב ~ 10 Hz. בדוק את התנגדות פיפטה; התנגדות אידיאלית היא בין 5 ל 10 MΩ עבור רוב נוירונים ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל נשיפה מהקצה. השתמש בשופר, או להשתמש במזרק, להפעיל לחץ חיובי כאשר פיפטה טובלת לתוך פתרון האמבטיה. ברציפות לכבות את הפתרון הפנימי עד הקצה הוא על פני השטח של תא המטרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הלחץ החיובי עושה גומה קטנה על הפני תא דואר, לקדם את הקצה מעט ולהפסיק נשיפה. בדוק את התנגדות פיפטה, אשר אמור להגדיל. אם הוא עולה בהתמדה, להשאיר אותו ולפקח על ההתנגדות עד שהוא מגיע&gt; GΩ 1 (gigaseal). אם ההתנגדות אינה מעלה באופן ספונטני, בעדינות להפעיל לחץ שלילי עד שהוא הופך gigaseal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר gigaseal מושגת, לשנות את פוטנציאל החזקה ל-70 mV. לאחר מכן, לסירוגין להפעיל לחץ שלילי להתפקע הקרום בתוך קצה פיפטה. כאשר התצורה כל התא מורכב, התנגדות פיפטה יכולה להיות בין 500 MΩ וGΩ 1, ונוכחי קיבולי נראה. לפעמים ניתן לראות זרמי postsynaptic ספונטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מערכת היחסים IV מ-80 ל+40 mV. סוגים שונים של ערוצי מתח מגודרת מופעלים בהתאם לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא אור עורר זרמים או מתחים הסינפטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy,+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording.">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina.">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li><li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina.">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li><li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina.">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li><li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells.">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li><li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells,+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina.">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li><li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina).">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li><li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina.">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li><li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+for+a+binary+synapse.">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li><li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina.">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li><li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat.">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li><li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A),+GABA(C)+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells.">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li><li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity).">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li><li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina.">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primordial,+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina.">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li><li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise.">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Good recordings can only be achieved with good retinal preparations and well-designed patch clamp setups. Although all the steps described above are important, the discussion highlights some critical steps both for the dissection and recordings. 
For dissection, two things are especially important: cooling and oxygenation. After enucleating the eye, quickly remove the front part of the eye in a dissecting chamber with oxygen-bubbled, cooled dissecting solution, and pour cold solution into the ...

The retina is one of the unique parts of the nervous system. As an accessible part of the brain, its synaptic architecture has been well characterized. In addition, the functions of this neural network can be examined with a physiological stimulus: light. If the retinal tissue is isolated in a dark room with appropriate procedures, neurons in the tissue will respond to light. This preparation has been used to study visual signal processing and elucidate various synaptic mechanisms and neural network functions, as well as disease mechanisms. 
Light responses in retinal neurons have been recorded for decades. Early studies used sharp electrodes to make intracellular recordings from mudpuppy retinal neurons1. In the 1980s, the patch clamp technique was invented2, and soon became a popular method among vision researchers3,4. Single cell recordings from lower vertebrates, including mudpuppy and fish retinal neurons, were popular methods that contributed to the elucidation of visual signal processing mechanisms5,6. 
After genetic mutation techniques were developed, the mouse retina became a more popular model for vision researchers7-9. The mammalian retina is more attractive than that of lower vertebrates because it is evolutionarily closer to the human retina, and there is an opportunity to use disease models. However, mouse retinal cells are small and fragile10, and making retinal preparations and conducting patch clamp recordings in a dark room is challenging. As technology has improved, diverse approaches have become available to study visual signaling mechanisms such as imaging studies11 and the electroretinogram (ERG)12. Nevertheless, single cell recording with the patch clamp method is still important because it is highly temporally and spatially sensitive compared to other methods. Therefore, we have continuously conducted patch clamp recordings and improved our methods to investigate visual signal processing in mouse retinal slice preparations13-15.
In this video tutorial, the protocols are presented with important tips. Good recordings can only be achieved with good preparation. Practicing animal dissection and building a sturdy patch clamp rig will enable most researchers to achieve successful recordings.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:203px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:323px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mice (28-60 days old, male)</td>
			<td style="width:145px;">Jackson laboratory</td>
			<td style="width:203px;">C57BL/6J strain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ames&#39; medium powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:203px;">A1420</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:145px;">Nikon</td>
			<td style="width:203px;">SMZ745</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissecting tool_forceps</td>
			<td style="width:145px;">Dumont</td>
			<td style="width:203px;">#4, #5, #55</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissecting tool_scissors</td>
			<td style="width:145px;">Roboz</td>
			<td style="width:203px;">RS-5605</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissecting tool_surgery knife</td>
			<td style="width:145px;">Surgistar</td>
			<td style="width:203px;">7514</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">razor blade (for chopper)</td>
			<td style="width:145px;">EMS</td>
			<td style="width:203px;">71970</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">chopper</td>
			<td style="width:145px;">handmade</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">infrared viewer</td>
			<td style="width:145px;">Night Owl Optics</td>
			<td style="width:203px;">NOBG1</td>
			<td>It shows bright view.&#160; Focusing small objects is an issue.</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">infrared pocket scopes</td>
			<td style="width:145px;">B.E. Meyers</td>
			<td style="width:203px;">OWL Gen 3 NV pocketscope</td>
			<td>excellent view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter</td>
			<td style="width:203px;">P-1000</td>
			<td>excellent.&#160; Make consistent size pipettes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dark box</td>
			<td style="width:145px;">Pelican</td>
			<td style="width:203px;">dark box</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">patch clamp system</td>
			<td style="width:145px;">Scientifica</td>
			<td style="width:203px;">slice scope 2000</td>
			<td style="width:323px;">Excellent setup.&#160; Most key components are included in one package.&#160; Micromanipulators are excellent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">amplifier</td>
			<td style="width:145px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:203px;">multiclamp 700B</td>
			<td>Excellent and easy control.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acquiring software</td>
			<td style="width:145px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:203px;">pClamp software</td>
			<td>Excellent and easy control.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:216px;">light source (LED)</td>
			<td style="width:145px;">Cool LED</td>
			<td style="width:203px;">pE-2 4 channel system</td>
			<td>Excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Q-imaging</td>
			<td style="width:203px;">Retiga 2000</td>
			<td>Excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Faraday cage</td>
			<td style="width:145px;">handmade</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques

הרשתית היא השער למערכת הראייה. כדי להבין את מנגנוני עיבוד אותות חזותיים, אנו חוקרים פונקציות רשת עצביות ברשתית. נוירונים ברשתית ברשת מהווים של תת סוגים רבים. יותר מ -10 תת-סוגים של תאים דו קוטביים, תאי הגנגליון ותאי amacrine זוהו על ידי מחקרים מורפולוגיים. תת מרובה של תאי עצב ברשתית הם חשבו לקודד תכונות מובהקות של איתות חזותית, כגון תנועה וצבע, ויוצרים מספר רב של מסלולים עצביים. עם זאת, התפקידים הפונקציונליים של כל נוירון בעיבוד אותות חזותי אינם מובנים במלואם. שיטת מהדק התיקון היא שימושית כדי לטפל בשאלה יסודית זו. כאן, פרוטוקול להקליט תגובות הסינפטי אור עורר בנוירונים ברשתית עכבר באמצעות הקלטות מהדק תיקון בתנאים כהים מותאם מסופק. עיני העכבר הן כהות מותאם O / N, והכנות פרוסת רשתית הם גזורים בחדר חשוך באמצעות תאורה וצופים אינפרא אדום. אור אינפרא אדום לאלהפעיל קולטני אור בעכבר ובכך שומר על היענות האור שלהם. מהדק תיקון משמש להקלטת תגובות אור עורר בנוירונים ברשתית. צבע ניאון מוזרק במהלך הקלטות לאפיין תת מורפולוגיות עצביות. הליך זה מאפשר לנו לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של כל נוירון ברשתית העכבר.

הכנת פרוסה נציג מוצגת באיור 1. הכנת פרוסה נמצאת בעמדה ישרה, מראה קולטניים אור לתאי הגנגליון במשטח שטוח, ולא ניתוק מנייר הסינון. אם הפרוסה מוטה, רק חלק מההכנה הוא בפוקוס, מה שהופך את זה קשה לזהות תא מתאים להידוק תיקון. להקלטות, חשוב לבחור סומה טובה, אשר בדרך כלל י...

Watch this Scientific Journal Video about Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques at JoVE.com

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Video: Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...