מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) Core גרנט (5P30EY008098) וקרנות הבאים XW: NIH גרנט R01EY016099 מחקר למניעת עיוורון בפרס פיתוח קריירה. אנו מודים לתרופ קירה לסיוע הדמיה confocal.

ביום 1. הכנה 1. הגדר חוצה דגים הגדר חוצה pairwise של דג הזברה בערב. כדי למנוע הזדווגות אקראית לפני הזמן הרצוי להשתמש חוצצים להפריד את הדג נקבה וזכר את קלטות ההזדווגות. GFP-לבטא דג מהונדס משמשים כמקור בלסטומרים התורם. השורה pt104 מהונדס (Zou et al., 2008), משמש כאן, מבטא GFP בכל מקום בגוף בשליטת היזם EF1. ביטוי של GFP מאפשרת ויזואליזציה של תאים מתורם חי על ידי הדמיה. אחרים הקווים דגים מהונדס המבטאים חלבוני ניאון מתאים ניתן להשתמש לצרכים ספציפיים. 2. הכן בצורת טריז agarose בארות לקיום העובר יוצקים agarose 1% נמס, מוכן במים ביצה E3 (Westerfield, 2007), לתוך צלחת פטרי. Float תבנית פלסטיק כי יש בצורת טריז בליטות על הפתרון agarose ולתת פתרון agarose לחלוטין לחזק. מוציאים את התבנית בזהירות לטבול את המיטה agarose עם מים E3. 3. הכן מחטים השתלה השתמש חולץ מחט אנכי (דוד KOPF מכשירים) בהספק הגדרה 11.5 לעשות מחטים על ידי משיכת pipettes זכוכית נימי (Precision כלי העולמי). טיפים מחט טוב צריך להתחדד עם פירים ארוכה. טוחנים את הטיפים המחט בזווית של 45 מעלות עם מטחנת Micro (Marishige) עד פתחים משופעים של 40-45μm בקוטר פנימי מתקבלים (איור 1A). כדי לנקות את עצות מחט, לצרף צינור בקצה הקהה של המחט, לחבר את הצינור מזרק, ולאחר מכן להתחנף ולשחרר פתרון 10% חומצה הידרופלואורית עד שכל פסולת גלוי מוסר. לאחר מכן, לשטוף עם מים מזוקקים עצות, ואחריו 100% אתנול. אוויר יבש המחטים עד שכל מתאדה אתנול. חשוב להבטיח כי טיפים הינם יבשים לחלוטין: אתנול שיורית יהרוס את המחטים במהלך שלב בטמפרטורה גבוהה ליטוש. כדי לרכך ולהבריק את הקצוות הגסים של מחט טיפים, עצות לאפות את המחט עם החום שנוצר על ידי נימה של זייפן Micro (Marishige). אל תתנו עצות מחט לגעת נימה במהלך ליטוש. כמות החשמל עובר אף נימה ואת המרחק בין החוט לבין עצות מחט יכול להיות מותאם כדי להשיג תנאים החימום הרצוי. הטמפרטורה לא צריך להיות גבוה מדי: זה יהיה להמיס לעוות את הטיפים מחט. אחרי הקצוות הגסים הם והחליק בזהירות לגעת נימה מחומם עם קצה מחט ולאחר מכן משוך בעדינות את החוט מן המחט כדי ליצור הקצה המחודד (איור 1B). מחט חד, חלק, נקי הוא קריטי להשגת בלסטומרים התורם שלם בשביל לא לפגוע בעוברים המארח. 4. הכנת תחקיר העובר, מיצוב משוך פיפטה כוס על אש הגז להשיג בדיקה זכוכית בסדר עם סוף והחליק. בדיקה זו תשמש לתפקיד עוברים בכיוון הנכון לקראת ההשתלה. יום 2. Blastomere השתלה 1. איסוף עוברים dechorionate למחרת, להסיר את המחיצות בין קלטות לחצות לאפשר דגים להזדווג. מניחים את העוברים בצלחת פטרי מלא מים E3. לאחר מכן, עוברים dechorionate באופן ידני על ידי קורעת את chorions מעוברים עם זוג מלקחיים בסדר. השתמש פיפטה זכוכית עם פיר התכופפה בזהירות העברת עוברים dechorionated agarose לתוך בארות. הימנעי מכל מגע של עוברים עם האוויר, הגורמת עוברים להתפוצץ. בואו העוברים להתפתח 28.5 מעלות צלזיוס בארות agarose עד 3 שעות שלאחר ההפריה, או hpf. 2. הגדרת מנגנון השתלה בעוד העוברים לפתח, להקים מנגנון ההשתלה על ידי חיבור מחט השתלה של שמן מינרלי מלא מערכת מיקרו שאיבה. ודא כי המערכת אינה נזילה ואין בועות אוויר לכודות במערכת. חזרה למלא את המחט השתלת שלם עם שמן מינרלי, למעט 0.5-1 μl של שטח בפתיחת קצה. 3. השתלה של בלסטומרים כדי השתלת בלסטומרים, השתמש בדיקה מיצוב זכוכית להתמצא הצד blastomere עוברים 3-4-hpf כלפי מעלה. ואז, בעדינות להכניס את המחט לתוך השתלת העובר תורם לאט להתחנף 5-20 בלסטומרים לתוך המחט. הכנס את המחט blastomere מלא לעובר מארח ולשחרר את בלסטומרים לאט. האתר שבו בלסטומרים משתחררים ישפיע שבו הצאצאים שלהם בתרגום בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר. כדי לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית, התאים לשחרר בקוטב בעלי חיים. במהלך ההשתלה, לוודא כי קצה מחט לא פנה האוויר. כדי למזער נזקים מכניים, עוברים המארח יהיה להשאיר את הבארות agarose ב 28.5 ° C עד למחרת. ואז, לאransfer את העוברים על פסיפס של 24 צלחות היטב מראש מצופה מ&quot;ל 0.5 agarose של 1%, עם עובר אחד טוב כל אחד. 1 מ&quot;ל מים ביצה E3 מתווסף גם כל אחד. כדי למנוע זיהומים חיידקיים, הוסף 10 μl של 100x פניצילין וסטרפטומיצין למים ביצה E3. יום 3. הטבעת הדמיה של עוברים לחיות פסיפס 1. הטבעת עוברים הכן 1.5% נקודת התכה נמוכה agarose (LMP) במים ביצה E3 ולשמור את פתרון אמבט מים 30 מעלות צלזיוס. העברת העובר פסיפס על צלחת תרבות FluoroDish רקמה עם תחתית כוס 0.17mm עובי (מכשירים העולם Precision). הסרה של עודפי מים E3 לעזוב את העובר מכוסה רק על ידי כמות מינימלית של E3. הוסף 30-50 μl LMP 1.5% נמס לעובר. במהירות למצב העין או המוח קרוב לתחתית הכוס ככל האפשר לפני הפתרון agarose מתמצק. לאחר הפתרון מתקרר, להוסיף פתרון נוסף agarose להמשיך לאבטח את העוברים במקום. לאחר מכן, לטבול את הקרושה agarose לחסום עם מים 2-3 ביצים E3 מ&quot;ל. 2. Confocal הדמיה עבור מיקרוסקופיה confocal, מטרה הפוכה טבילה במים (אולימפוס, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, יפן) עם עומק מוקד גדול משמש. טיפת מים נוסף על המטרה ואז במקום רקמת FluoroDish תרבות צלחת על המטרה. כדי פיתוח תמונה, לבצע זמן לשגות הדמיה על ידי לקיחת תמונות של עוברים כל 5 דקות. בהתאם לאופי של ניסויים, מרווחי הזמן בין הזריקות צריך להיות מותאם. נציג תוצאות איור 2 ממחיש נציג 24-hpf דג הזברה פסיפס. ביטוי של GFP מדגיש את התאים התורם בירוק. התאים neuroepithelial רשתית טווח עובי כל קיר הרשתית. הסרט מראה את התנועות של תורם התאים במוח לארח בבית hpf 24. תאים מורפולוגיות שימו לב להשתנות עם הזמן. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. צורות של טיפים מחט ההשתלה. א פתיחת משופעים של קצה מחט היה חופשי של פסולת לאחר שוטף חומצה הידרופלואורית. ב הקצה המחודד נוצר בקצה המחט. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ויזואליזציה של ה-GFP-לבטא בתאי התורם עוברי דג הזברה chimeric ב hpf 24. הלוח השמאלי מציג את אותות ה-GFP במוח הרשתית. הלוח המרכזי הוא תמונה בשדה בהיר של העובר. הפאנל הימני מראה את התמונה הממוזג. סרט 1. הדמיה חיה של תאים GFP תורם חיובי הראו שינויים נרחבים מורפולוגיות של תאים neuroepithelial המוח במהלך ההתפתחות. מסגרות בודדות של הסרט נאספו כל 5 דקות בין 24 לבין 25 hpf. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">לחץ כאן כדי לראות את הסרט</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה blastomere השתלת לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית דג הזברה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים, פשוט על ידי שחרור בלסטומרים התורם למקומות המתאימים את העוברים המארח. תיוג עם מולקולות ה-GFP התשואות רקע נקי יותר עם תי?...

E3 מים ביצה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.17 mM KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתילן כחול 0.1% </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

תאים לשנות בהרחבה במקומות ורכושם במהלך embryogenesis. שינויים אלה מוסדר על ידי יחסי הגומלין בין התאים לבין סביבתם. עוברים chimeric, אשר מורכב של תאים בעלי רקע גנטי שונה, הם כלי נהדר ללימוד תאים תאים אינטראקציות בתיווך גנים של עניין. השקיפות של דג הזברה העובריים בשלבים התפתחותיים מוקדם היתרי להדמיה ישירה של המורפוגנזה של רקמות ואיברים ברמה התאית. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול ליצור הרשתיות chimeric והמוח עוברי דג הזברה ולבצע הדמיה חיה של תאים התורם. פרוטוקול מכסה את הכנת מחטים ההשתלה, השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים התורמות GFP שלילי המארחים, ועל בחינה של התנהגות תורם התא תחת מיקרוסקופ confocal לחיות. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את ההתפתחות העוברית של רקמות ואיברים אחרים דג הזברה. היתרונות של שימוש GFP לתאי התורם התווית הם דנו גם.

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos at JoVE.com

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  University of Pittsburgh. אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

Video: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.