אנו מודים Chunxin וואנג לבניית pTSO2: גאס עבור תמונות באיור 1, דטלף ווייגל לשיתוף פרוטוקול גאס-חסינת תקלות, פג&#39;ה Sijacic, ואת קורטני הולנדר על הערות מועילות. מחקר במעבדה של צ&#39;L נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של ​​מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.

I. Floral-לטבול הטרנספורמציה של thaliana ארבידופסיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 חודש לפני השינוי, לזרוע זרעי ארבידופסיס על 4-8 סירים (5 סירים מרובע אינץ&#39;) עם כ 10-15 צמחים לכל סיר. לקבלת צמחים עם פריון תקין, 4 סירים של צמחים לכל לבנות הפלסמיד יהיה מספיק. אם יש להפוך ארבידופסיס מוטנט עם בפוריות, להגדיל את מספר סירים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמחים גדלים בתנאים סטנדרטיים (16 שעות אור ו 8 שעות חושך על 22 ° C). אם הצמחים גדלים תחת יום קצר יותר או טמפרטורה נמוכה יותר, הם ייקחו עוד פרחים כבר להיות מוכנים לשינוי. הצמח טוב לטיפול יבטיח צמחים בריאים, שהם חיוניים טרנספורמציה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הצמחים יש רק בריח והחלו פרח. עכשיו הם מוכנים לשינוי. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, 3-4 ימים לפני השינוי, לקצץ את יורה תפרחת העיקרי בהקדם להם מוברג לעודד היווצרות לירות משני יותר. המים צמחים יום לפני השינוי. הדבר מבטיח כי האדמה לא לספוג התקשורת חדירה יותר מדי במהלך פרחים בעירום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני השינוי, לחסן LB 40ml המכילות אנטיביוטיקה המתאימה (במקרה של pTSO2: גאס, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל Kanamycin) עם Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 נושאת את pTSO2: גאס לבנות. PTSO2: גאס הוא משובטים ב וקטור pBIN20 כי בעל הגן NPTII כי מקנה עמידות Kanamycin 3. לגדול לילה חממה רועד ב 28-30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, 8ml העברת התרבות בין לילה לתוך 400ml של LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Kanamycin. לגדול לילה חממה רועד ב 28-30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של טרנספורמציה, כאשר OD 600 של התרבות Agrobacterium ומגיע לכ 0.8 (OD 600 בין 0.5 to1 מקובלים), ספין מטה התרבות לילה Agrobacterium בבית במשך 8 דקות 5000rpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה Agrobacterium ב L 1 (ליטר) של התקשורת הסתננות (10mm MgCl 2, סוכרוז 5%, 0.44mM 6-benzyladenine (BA), 0.3% silwet L-77, ויטמין 1x s Gamborg פתרון ומים autoclaved). המדיום אינו צריך להיות autoclaved אבל צריך להיות טרי. יוצקים את 1 Agrobacterium המכילים L בינוני חדירה לתוך צלחת (כגון 8 &quot;x15&quot; x2 &quot;צלחת פיירקס זכוכית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הסיר (צמחים לא תיפול) ו לטבול את כל חלקי אוויר של הצמחים לתוך הפתרון הסתננות, להחזיק במשך 5 דקות סיר אחד בכל פעם. בעוד כל החלקים אוויר של המפעל שקועים המדיום הסתננות, להימנע לתת אדמה לספוג כל חדירה של התקשורת להפחית את הסיכויים של גידול פטרייתי על האדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טבילה, מקום כל הסירים טבל בצד שלהם על כמה שכבות של מגבת נייר במגש. מגבות נייר לספוג כמות גישה של התקשורת הסתננות. מכסים את המגש בניילון נצמד, כדי להבטיח לחות גבוהה. מניחים את המגש לחדר גידול צמחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את ניילון ומגבות נייר, סירים מקום זקוף. אין מים הצמחים האלה עבור 4-5 ימים נוספים. לאחר מכן, לשמור את הצמחים בדרך כלל עד שהם קבוצה זרעים לאסוף זרעים בתפזורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים צלחות (צלחת פטרי 150x15mm) עם בינוני MS המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Kanamycin (משקל 2.2g Murashige ו Skoog מלח הבסיס ללא ויטמין, להמיס 500 חומציות המים, עד 5.8 מ&quot;ל עם NaOH 1M, הוסיפו 4 גרם אגר, החיטוי, קריר כדי להוסיף Kanamycin 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי). פלטות נשמרים 4 ° C עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחור עבור עמידים לאנטיביוטיקה הצמחים הטרנסגניים, צריך מסך 20,000 זרעים לכל הפחות. 0.1 גרם הוא כ 5000 הזרעים. משקל להעריך את כמות הזרעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר זרעים ידי לשטוף אותם בצינור פלקון 15 מ&quot;ל עם אתנול 70% למשך 30 שניות. לשטוף עם מים סטריליים זרעים פעם. משרים את הזרעים למשך 30 שניות בתמיסה המכילה דילול של 1:10 אקונומיקה קנויה 5% (מלבין). יש לשטוף את הזרעים עם מים סטריליים 3-6 פעמים. בשכונה סטרילי, על פיפטה 5000 זרעי על כל צלחת MS (Kanamycin), להפיץ את הזרעים בצורה שווה על הצלחת, לאטום את צלחות עם הקלטת 3M micropore כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 4 ° C בחושך במשך 3-4 ימים, ולאחר מכן להעביר את הצלחות לחדר (יכול להיות באותו חדר גידול צמחים). לאחר כ 14 ימים, שתילים מהונדס להישאר ירוק אך לא מהונדס אלה הופכים חיוורים גוסס. מעבירים את השתילים מהונדס לקרקע על ידי האטת קצב משיכת השורשים מן המדיום והניחה אותן באדמה. </li></ol> השנייה. בחינת pTSO2: גאס דפוסי הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר pTSO2: גאס שתילים מהונדס ומכניסים אותם אצטון 90% קר בקבוקון זכוכית scintillation או צינורות microfugeכי הם שמרו על הקרח. Microtiter לוחות פוליסטירן (לא פוליפרופילן) יכול לשמש גם אם מנתח מספר גדול של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל דגימות נקצרים, במקום בקבוקוני בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך תקופה זו לפצות חיץ מכתים טריים ללא x-Gluc (0.2% Triton x-100, 50mm NaHPO 4 הצפת pH7.2, 2mm אשלגן אשלגן פרוציאני, 2mm Ferricyanide) ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אצטון ממדגמים ומוסיפים את החיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפרים x-Gluc פתרון מכתים (0.2% Triton x-100, 50mm NaHPO 4 הצפת pH7.2, אשלגן אשלגן 2mm פרוציאני, 2mm Ferricyanide, 2 מ&quot;מ x-gluc). הסר את חוצץ מכתים ממדגמים ולהוסיף החיץ מכתים המכיל x-Gluc על דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסתנן דגימות תחת ואקום עבור 15 עד 20 דקות. לשחרר את הוואקום לאט לוודא שכל הדגימות לשקוע מתחת לפני השטח של הפתרון מכתים. אם יש צורך, חזור על חדירה עד לשקוע כל הדגימות לאחר ואקום הוא שוחרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה למאגר מכתים עם ה-X Gluc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות חממה ולהסיר חיץ מכתים. שטפו את דגימות בסדרה אתנול רצופים (20%, 35% אתנול ו - 50%) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כל אחד מהשינויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הרקמות FAA מקבע (אתנול 50%, 5% פורמלדהיד, חומצה אצטית 10% מים, מנוחה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר FAA ולהוסיף אתנול 70%. בשלב זה רקמות ניתן דמיינו וצילם תחת מיקרוסקופ לנתח מצויד במצלמה דיגיטלית. צבע כחול כהה מציין היכן TSO2 מתבטא (איור 1). לחלופין, הרקמות ניתן לאחסן 4 ° C מאוחר יותר לצפייה. <img src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 pTSO2:.: גאס ביטוי ב שתילים מהונדס (A), שורשים לרוחב (B), ואת קצה השורש (C). שים לב TSO2 האמרגן פעיל מאוד ברקמות צעירים חלוקת. דפוס הביטוי ספורדיים שמוצג (C) אופייני של הגנים מתבטאת שלבי מחזור התא הספציפי. </li></ol> נציג תוצאות כאשר נעשה בצורה נכונה, יעילות השינוי צריך להיות כ 0.1-0.2%. במילה אחרת, יש לקבל שתילים מהונדס 5-10 על ידי סינון כל הזרעים 5000. בממוצע, כ - 100 קווי מהונדס ניתן להשיג על ידי הפיכת 4 סירים של wild-type צמחים. עבור שתילים מהונדס המכיל את pTSO2: גאס לבנות 3, בצבע כחול כהה המשקף פעילות גאס נמצא פעיל התאים המתחלקים כולל עלים צעירים, איפקס לירות, קצה השורש, ושורש primordia לרוחב (איור 1). התבנית לא אחידה סדיר אופייני מחזור התא בשלב ספציפי הביטוי.

<ol>
	<li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation.">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li><li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression,+DNA+damage+repair,+and+plant+development.">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היעילות של השינוי נקבע על ידי גורמים רבים ושונים, אשר נדון להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריאות הצמחים ואת גילם הם בעלי חשיבות ראשונית. בערך אחד הצמחים ישנים חודש לייצר מספר רב של בלוטות פרחים בשלה הם אידיאליים. זמירה את יורה העיקרית לעודד מ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>6-benzyladenine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>852430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silwet-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crompton Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Toxic, wear gloves</td>
</tr>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg's vitamin solution 1000X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-glucuronide cyclohexamine salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biosynth</td>
<td>B-7300</td>
<td>Toxic, light sensitive keep in the dark</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropore 3M Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19027761</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

floral-dip transformation of arabidopsis thaliana to examine ptso2::&beta;-glucuronidase reporter gene expression

היכולת להכניס גנים זרים לתוך אורגניזם היא הבסיס הביולוגיה והביוטכנולוגיה המודרנית. בשנת הצמח פורח מודל<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt;, פרחים, לטבול שיטת הטרנספורמציה<sup&gt; 1-2</sup&gt; החליף את כל השיטות הקודמות בגלל הפשטות שלה, יעילות, ועלות נמוכה. באופן ספציפי, יורה פריחה צעיר<em&gt; ארבידופסיס</emצמחים&gt; הם טבול בתמיסה של<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; נושא בונה פלסמיד מסוים. לאחר טבילה, הצמחים הם חזרו לצמיחה נורמלית זרעים תשואה, אחוז קטן מהם הופכים עם גן זר יכול להיבחר על מדיום המכיל אנטיביוטיקה. שיטה זו פרחוני לטבול הקלו באופן משמעותי<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; מחקר תרמו רבות להבנת תפקוד הגן צמח. במחקר זה, אנו משתמשים פרחים לטבול שיטה להפוך את גן הכתב,<em&gt; Β-glucuronidase (גאס)</em&gt;, תחת שליטתו של<em&gt; TSO2</em&gt; האמרגן.<em&gt; TSO2</em&gt;, קידוד עבור reductase ribonucleotide (RNR) למקטע קטן<sup&gt; 3</sup&gt;, הוא מחזור התא גן מוסדר חיוני ביוסינתזה dNDP בשלב-S של מחזור התא. בחינת<em&gt; גאס</em&gt; ביטוי מהונדס<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שתילים מראה כי<em&gt; TSO2</em&gt; בא לידי ביטוי באופן פעיל בחלוקת הרקמות. שיטה ניסיונית דיווח וחומרים ניתן להתאים בקלות בתיכון רמות המכללה לא רק למחקר אלא גם עבור החינוך.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::Î²-glucuronidase Reporter Gene Expression at JoVE.com

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים שיטת<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; בתיווך הטרנספורמציה של<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt;. על ידי החדרת תא מחזור מוסדר האמרגן, כתב,<em&gt; PTSO2: β-glucuronidase (גאס)</em&gt; אל<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; אנו מדגים כיצד מזהה ביטוי גאס הכתב שתילים מהונדס.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

floral-dip-transformation-arabidopsis-thaliana-to-examine-ptso2

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

35.8K Views.  University of Maryland College Park. מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים שיטת Agrobacterium tumefaciens בתיווך הטרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana. על ידי החדרת תא מחזור מוסדר האמרגן, כתב, PTSO2: β-glucuronidase (גאס) אל ארבידופסיס אנו מדגים כיצד מזהה ביטוי גאס הכתב שתילים מהונדס.

Video: Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

חקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות הדמיה קונפוקלית

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Author Spotlight: שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...