המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי משרד הבריאות של פנסילבניה, רפואי אליסון, V ו יסודות אמרלד.

1. ביטוי רקומביננטי טרט Tc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 6 L של 2YT התקשורת (6 x 2 L נבוך צלוחיות Erlenmeyer המכיל 1 ליטר של מרק 2YT בכל אחד) מתוך שש צלחות טריים של תאים pLysS הפך רוזטה (DE3) המכיל את סינתטיים Tc טרט פלסמיד עם TeV N-מסוף cleavable hexahistidine- תג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים לגדול ב 37 ° C תוך רועד בסל&quot;ד 220 עד 600 OD של 0.5-0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס, איטי רועד עד 150 סל&quot;ד, ולאפשר לתאים לבטא חלבון 4-5 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C ו - 3500 סל&quot;ד למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל 1 תא L גלולה ב 20 מ&quot;ל של המאגר המכיל 25 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 0.5 מ &#39;KCl, 15 מ&quot;מ Imidazole, 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 sulphonyl phenylmethyl mM פלואוריד (PMSF) ו benzamidine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא resuspended תערובת תאים על ידי לאט מטפטף את התאים לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי פלסטיק מלא חנקן נוזלי, כך כל טיפה קופאת על ההשפעה של נוזלי N 2. חנות תאים קפואים ב -80 ° C עד מוכנים לטיהור חלבונים. </li></ol> 2. טיהור Tc טרט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים להפשיר בטמפרטורת החדר עד למרקם נוזלי הוא הגיע ולאחר מכן לעבור כוסות מתכת על קרח sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate תאים על קרח דק 2 ב 30 מרווחי השני עם 30 second הפסקות, על כ 51 וואט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים lysed בסל&quot;ד 18,000 עבור 20 דקות להפריד את החלבון שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ובזהירות להסיר את supernatant עבור כרומטוגרפיה זיקה ניקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן Ni-נ.ת. ע (ניקל nitrilotriacetic חומצה) טור עם מאגר המכיל 25 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 0.5 מ &#39;KCl, 15 מ&quot;מ imidazole, 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 מ&quot;מ PMSF ו benzamidine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען supernatant על שרף לאסוף את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם חוצץ המכיל 25 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 מ&quot;מ KCl, 15 מ&quot;מ imidazole, 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 מ&quot;מ PMSF כדי להסיר את כל החלבונים מחויב שיורית ולא באופן ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute Tc טרט של שרף Ni-נ.ת. ע באמצעות שיפוע imidazole של 15-300 מ&quot;מ לאסוף 3 שברים מ&quot;ל לניתוח SDS PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדף &#39;ניתוח כדי לקבוע אילו שברים מכילים חלבון Tc טרט ולהתרכז אלה שברים ב Amicon 30 kDa (Millipore) לסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז Tc שברים טרט לנפח פחות מ -10 מ&quot;ל לטיהור נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרט Tc מטוהרים נוסף על עמודה קטיון מטבע (HS פורוס, Applied Biosystems) מראש equilibrated עם חוצץ המכיל 25 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 KCl mM, ו 1 DTT מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת החלבונים על העמודה HS פורוס לשטוף אותה להסיר את כל חלבון ומזהמים חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם חוצץ המכיל 500 KCl mM ואחריו mM 700 KCl להסיר כל המזהמים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון טרט Tc את הטור HS פורוס עם חיץ 1 KCl ז. בשלב זה החלבון צריך להיות יותר מ 99% טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אגרגטים חלבון על ידי העברת חלבון על עמודה אומדת Superdex-200 (הרחקה גודל כרומטוגרפיה - GE Healthcare), טרום equilibrated עם מאגר המכיל 25 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 מ&quot;מ KCl, ו 1 TCEP מ&quot;מ. </li></ol> 3. Tribolium castaneum תרבות חיפושית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ט castaneum חיפושיות שבה סיפקה בתחילה כמתנה על ידי ד&quot;ר ס &#39;בראון, חטיבה של ביולוגיה, קנזס סטייט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ט castaneum התרבות על ידי הוספת 100 חיפושיות בוגרות מכולה עם 28.5 גר &#39;קמח 1.5 גרם של שמרים יבשים של האופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות תרבויות חיפושית בטמפרטורת החדר בסביבה, חשוך ולח במשך שלושה עד ארבעה שבועות, כדי לאפשר רבייה וגדילה. מניחים כוס המכילה מים באזור אחסון חיפושית כדי להבטיח סביבה לחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הזחלים חיפושית כנדרש עבור בידוד RNA. אפשר הזחלים הנותרים להבשיל למבוגרים, לשמור אותם באותה תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל חודש, להעביר את חיפושיות הפעילים ביותר (לא יותר ממאה) לתוך בקבוק חדש המכיל קמח שמרים טריים לחדש אספקת המזון שלהם. </li></ol> 4. ט castaneum סך RNA בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 קציר חיפושית הזחלים מן התרבות (כל תרבות צריכה להכיל בין הזחלים 5-100) על ידי הפרדתם חיפושיות מבוגר ותרבות קמח / שמרים. סלקו קמח או חלקיקים שמרים המחוברים חיפושיות לפני שחיקה אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור הספסל, המלט, ואת העלי (לשקול טיפול בכפפות גם) המשמש בהליך זה עם RNaseZap (Ambion, Inc) כדי להסיר את כל עקבות של ribonucleases לפני שחיקה החיפושיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים הזחלים בנוזל N 2 לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי ו transfer את האבקה אל צינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל, תוך שמירה על נוזלי N 2 על מנת להבטיח כי האבקה נשאר קפוא עד החיץ החילוץ הוא הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר נוזל עודף N 2 להתאדות מן האבקה. לאחר N נוזלי 2 התאדו, homogenize את אבקת חיפושית ב 200 μl של חיץ החילוץ (לכל הזחלים 20 חיפושית) המכיל 25 מ&quot;מ טריס-HCl, 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 1 mM EGTA, benzamidine 0.1 מ&quot;מ, 200 מ&quot;מ KCl, 10 גליצרול%, 10 mM imidazole ו 20U של RNasin, pH 7.5 ו לדגור על קרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate 15,000 סל&quot;ד במשך 20 דקות ב 4 ° C, לאסוף את supernatant ופלאש להקפיא את מדגם N נוזלי 2. במידת הצורך, ניתן לאחסן דגימות ב -80 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את סך RNA באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen). </li></ol> 5. הכינון מחדש במבחנה של telomerase castaneum Tribolium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 20 מיקרוגרם של רקומביננטי שלו מתויג Tc טרט עם 50 μl של ט &#39; castaneum RNA סך למאגר מחייב המכיל 25 מ&quot;מ טריס-HCl, 200 מ&quot;מ KCl, גליצרול 10%, 5 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 10 mM imidazole, pH 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה טרט Tc - סך הכל תערובת RNA במשך שעתיים על 22 מעלות צלזיוס ט castaneum lysate בנוכחות מעכב RNasin כדי למנוע השפלה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מורכבות על עמודה Ni-נ.ת. ע כדי להסיר זיהומים lysate ו-RNA עודף. </li></ol> 6. לחזור telomerase הגברה פרוטוקול (מלכודת) מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 4 מיקרוגרם של Ni-נ.ת. ע מטוהרים ט telomerase castaneum במאגר התארכות 50 μl המכיל 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH - 8.3), 7.5 mM MgCl 2, 63 mM KCl, 0.05% Tween 20, 1 mM EGTA, BSA 0.01%, 0.5 dNTPs מ&quot;מ, 1 מיקרומטר TCAs-TS דנ&quot;א פריימר (5&#39;-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 &quot;), ואת דגירה את התערובת על 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לאפשר התארכות של פריימר TCAs-TS את ה-DNA על ידי T. מחדש castaneum telomerase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה-DNA מוארכת חד גדילי (ssDNA) על ידי הוספת נפח שווה של פנול כלורופורם לתערובת התגובה. לנער את התערובת בעדינות עד אמולסיה היא הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם בסל&quot;ד 12,000 למשך חמש דקות בשעה 4 ° C כדי להפריד את ssDNA של מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית העליון של המדגם כדי צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל; להוסיף הריכוז הסופי של 10 mM NaOAc (pH 5.0), 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו - 66.4% EtOH ולאחר מכן לאפשר את המדגם כדי לזרז לילה ב -20 ° ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם בסל&quot;ד 15,000 במשך שלושים דקות 4 ° C עד גלולה ssDNA זירז. למזוג את הפתרון באמצעות pipettor ולאחר מכן להוסיף 200 μl של EtOH 70% המדגם לשטוף NaOAc הנותרים MgCl 2 מן המדגם. צנטריפוגה מדגם במשך חמש דקות במהירות את הטמפרטורה באותו המדגם מחדש גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את הפתרון EtOH באמצעות pipettor ולהסיר שאריות של אתנול בכך שהוא מאפשר את הצינור Eppendorf כדי לדגור לפתוח בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר בהווה אתנול במדגם יפריע לשלב הגברה PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ssDNA (המכיל את המוצר telomerase מאורכים תחל TCAs-TS) ב 50 μl של חיץ תגובת PCR המכיל 10 mM טריס-HCl (pH 8), 50 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 100 dNTPs מיקרומטר (dATP, dGTP ו dTTP), 10 מיקרומטר [32 טז] dCTP, 1 TCAs-CX מיקרומטר פריימר (5&#39;-GTGTGACCTGACCTGACC-3 &quot;) ו - 1.25 U-DNA פולימראז תקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את התארכות telomerase המוצרים (29 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, ו - 72 ° C עבור 1 דקה), כך שהם נראים על ג&#39;ל polyacrylamide 12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל עם 12% טריס-borate-EDTA (TBE) מפעיל מאגר המכיל 44.5 mM טריס, חומצה 44.5 mM בור, 1 mM EDTA, pH 8 במשך שלושים דקות לפני ריצה את דגימות ה-PCR. לאחר שלפני ריצה טעינת ג&#39;ל עם התגובות PCR, הפעל את הג&#39;ל על 185 וולט עבור 1.5-2 שעות 4 מעלות צלזיוס או על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הג&#39;ל ולהשתמש צלחת הדמיה זרחן לדמיין פעילות. </li></ol> 7. נציג תוצאות: דוגמה של Tc מטוהרים כרומטוגרפיה טרט לאחר הרחקה גודל מוצג באיור 2. חלבון מרוכז לאחר טיהור מנוהלת על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide 12% ו מוצגת להיות יותר מ 99% טהור (איור 2 א). הדרה גודל (S200) chromatogram הוא גם סיפק (תרשים 2B) כדי להדגים את חוסר הטוהר של אגרגטים מן המדגם חלבון מטוהרים. תשואה של 5 מ&quot;ג חלבון אחרי כל השלבים לטיהור הושלמו מתקבל בדרך כלל על אף התשואה הסופית יכולה להשתנות. מלכודת נציג assay עבור ט מחדש telomerase castaneum מוצג באיור 3 כפי שדווח קודם לכן על ידי מיטשל et al. 12. הסולם צעד נבון של מוצרים telomerase ניתן לראות במסלול 1, אולםהם נעדרים telomerase הן RNase מטופלים הפעיל טרט אתר מוטנט (D251A) דגימות מסלולים 2 ו -3 בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים זרימה של שלבי הכינון מחדש של רקומביננטי Tc טרט. ראשית, רקומביננטי Tc טרט היא ביטוי יתר של E. coli. חלבון הוא מטוהרים מכן על ידי ניקל, חילופי קטיונים, והדרה כרומטוגרפיה גודל. ט חיפושיות castaneum הם מתורבת בבית וזחלים שלהם משמשים כדי לבודד את הרנ&quot;א מוחלט. Tc מטוהרים טרט ואת RNA סך מעורבבים ואז לחדש את מורכבות RNP telomerase, וכן assay המלכודת הבאים משמש כדי לאשר את מורכבות RNP הוא telomerase פעיל. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הדרה גודל chromatogram וניתוח SDS PAGE של חלבון טרט Tc. (א) 12% SDS-polyacrylamide ג&#39;ל של החלבון Tc טרט לאחר כרומטוגרפיה הדרה גודל. החלבון טרט Tc (70 KDA) נודד מהר יותר על ג&#39;ל SDS PAGE כי יש לו נקודה isoelectric גבוהה (PI - 9.8). (ב) הרחקה גודל chromatogram (Superdex S200) של החלבון Tc טרט. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מבחני המלכודת של במבחנה מחדש telomerase Tribolium castaneum עיבוד מיטשל et al. 12. ליין 1: בר סוג Tc טרט ו-RNA שבודד סך זחלי החיפושית. ליין 2: בר סוג Tc טרט ו RNase טיפול הכולל זחלים RNA ותמציות התא. ליין 3: פעיל באתר מוטציה Tc טרט (D251A) וסך זחלי החיפושית RNA הזחלים.

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת ייצור של כמויות גדולות של למקטע הקטליטית של ט &#39; castaneum טרט telomerase בצורת, מסיסים פעיל ללימודי מבניים ביוכימיים. השיטה של Tc טרט יתר ביטוי רגיש שינויים עדינים בטמפרטורה או צפיפות התאים מאלה כאמור לעיל יכול להשפיע באופן דרמטי את רמות ביטו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> רוזטה (DE3) plysS תאים </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT מרק </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> זהב ביוטכנולוגיה </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> אקטע מטהר FPLC </td><td> GE מדעי החיים </td><td></td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע Superflow שרף </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 מכשיר סינון צנטריפוגלי </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> פורוס 50 HS-Exchange הקטיון חזקה אריזה </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> פורוס 50 HQ Exchange הקטיון חזקה אריזה </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 גודל, הרחקת טור </td><td> GE מדעי החיים </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> פנול: כלורופורם: Isoamyl 25:24:1 עם 10mm טריס, pH 8, 1mm EDTA </td><td> סיגמא </td><td> P3803-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> רקומביננטי אינהיביטור Ribonuclease Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> ה-DNA oligonucleotides </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (Tc טרט) ואת הכינון מחדש של ט פעיל ribonucleoprotein castaneum telomerase (RNP) מורכב במבחנה. Telomerase הוא transcriptase הפוכה התמחה 1 המוסיפה חוזר דנ&quot;א קצרים, נקרא הטלומרים, עד הסוף &#39;3 ​​של כרומוזומים ליניארית 2 המשמשים כדי להגן עליהם מפני היתוך end-to-end והשפלה. בעקבות שכפול הדנ&quot;א, קטע קצר הוא איבד בסוף כרומוזום 3 וללא telomerase, התאים ממשיכים להתחלק עד שבסופו של דבר להגיע הגבלת Hayflick שלהם 4. בנוסף, telomerase הוא רדום ברוב התאים הסומטיים 5 אצל מבוגרים, אך היא פעילה 6 תאים סרטניים בהם הוא מקדם את אלמוות תא 7. האנזים telomerase מינימלי מורכבת משני רכיבי הליבה: למקטע החלבון (טרט), אשר כוללת את למקטע הקטליטי של האנזים ואת מרכיב בלתי נפרד RNA (TER), אשר מכיל את תבנית משתמש טרט לסנתז הטלומרים 8,9. לפני 2008, רק מבנים בודדים לתחומים telomerase נפתרו 10,11. פריצת דרך משמעותית בתחום זה בא קביעת המבנה הגבישי של 12 הפעיל, למקטע הקטליטית של ט &#39; telomerase castaneum, Tc טרט 1. כאן, אנו מציגים שיטות להפקת כמויות גדולות של טרט פעיל, Tc מסיסים ללימודי מבניים ביוכימיים, ואת הכינון מחדש של המתחם telomerase RNP במבחנה עבור מבחני פעילות הטלומרז. סקירה של שיטות ניסיוניות בשימוש מוצג באיור 1.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (<em&gt; Tc</em&gt; טרט) ואת הכינון מחדש של פעיל<em&gt; ט castaneum</em&gt; Telomerase ribonucleoprotein (RNP) מורכב<em&gt; במבחנה</em&gt;.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

in-vitro-reconstitution-of-the-active-t-castaneum-telomerase

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

11.6K Views.  University of Pennsylvania. המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט ( Tc טרט) ואת הכינון מחדש של פעיל ט castaneum Telomerase ribonucleoprotein (RNP) מורכב ?...

Video: In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomeres are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse in length and in humans can reach a length of 15,000 base pairs. The telomere serves as a bioprotective mechanism of chromosome attrition at each cell division. At a certain length, telomeres become too short to allow replication, a process that may lead to chromosome instability or cell death. Telomere length is regulated by two opposing mechanisms: attrition and elongation. Attrition occurs as each cell divides. In contrast, elongation is partially modulated by the enzyme telomerase, which adds repeating sequences to the ends of the chromosomes. In this way, telomerase could possibly reverse an aging mechanism and rejuvenates cell viability. These are crucial elements in maintaining cell life and are used to assess cellular aging. In this manuscript we will describe an accurate, short, sophisticated and cheap method to assess telomere length in multiple tissues and species. This method takes advantage of two key elements, the tandem repeat of the telomere sequence and the sensitivity of the qRT-PCR to detect differential copy numbers of tested samples. In addition, we will describe a simple assay to assess telomerase activity as a complementary backbone test for telomere length.

An accurate, short, sophisticated and cheap method is described that assesses telomere length in multiple tissues and species using qRT-PCR. In addition, we will describe a simple assay to assess telomerase activity as a complementary backbone test for telomere length.

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...