עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS27501 DKOD. תמיכה נוספת עבור עבודה זו סופק על ידי מענק קליפורניה תמיכה DKOD באמצעות תוכנית פרופ HHMI.

הכנות לפני יום culturing: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון מנתחים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את DMEM סטרילית ושומרים aliquots 10 מ&quot;ל ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סטרילי DDM2 תוספי הקפאת 50 או 100 aliquots μl במשך חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את ConA / laminin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל coverslips. אופציונלי: בצע CNBM חנות סטרילית להקפיא עד 4 חודשים. </li></ol> ביום של culturing I. הכן פתרון אנזימים (ES) במנדף תזרים למינרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 5 מ&quot;ל של ביתור פתרון (DS) בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 0.8 מ&quot;ג ציסטאין-L ב 0.6 מ&quot;ל Eppendorf ולהוסיף 150 μl של DS. פיפטה למעלה ולמטה עד הקריסטלים נעלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 150 מ&quot;ל של DS / ציסטאין על DS 5 מ&quot;ל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 U (יחידות) של Papain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של 0.1 N Na OH ומערבבים היטב. הפתרון יהיה ברור בתוך 30 דקות. כאשר מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזים פתרון סינון עם מסנן 0.2 מ&quot;מ מזרק לתוך צינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל כובע בורג microfuge Papain: רוצה 50 U DS ב 5 מ&quot;ל. כל אצווה שונה במקצת, אז צריך לחשב כמה: 37.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 28.3 U / מ&quot;ג 37.3 x 28.3 = 1055.59 U / ml (1000 מ&quot;ל) 50 U = 47.4 מ&quot;ל </li></ol> השנייה. הפוך את DDM2 התקשורת ביום של culturing: להוסיף את התוספים הבאים כדי DDM2 עד 10 מ&quot;ל של DMEM להוסיף את התוספים, ממש לפני culturing: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl transferrin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl Putrescine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl סלניום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl הפרוגסטרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50μl אינסולין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl 20-Hydroxyecdysone </li></ol> הערה: בצע מספיק DDM2 לכל התרבויות המתוכנן (כל המוח מצופה על coverslip יחיד צלחת פטרי 35 מ&quot;מ בודדים, 1.5 ms התקשורת / תרבות) שלב III-VI יכול להיות על הספסל נעשה במעבדה nonsterile ואמור להסתיים תוך 45 דקות או פחות. ג. אוסף גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10-15 גלמים משני של הבקבוקון תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום גלמים במכסה של צלחת פטרי 35 מ&quot;מ יבש. </li></ol> הערה: אנו משתמשים בדרך כלל במוחם של גלמים בין 55-78 שעות לאחר היווצרות puparium (APF). זה מעט קשה יותר לנתח את המוח של גלמים הצעיר מאז כמוסות ראש נוטים לקרוס, בעוד הרמה הכללית של תולדה neurite נמוכה מעט מ גלמים הבכור. בשנת המתח wildtype קנטון-S, בשלבים אלה מוכרים על ידי פיגמנט בעיניים כי הם חום בהיר עד מעט אדמדם, עם פיגמנט מעט במקום אחר. IV. עריפת ראש תחת מיקרוסקופ לנתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי טיפות של תמיסת לנתח סטרילי בתוך מכסה של צלחת פטרי, ליד גלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק גולם אחד עם מלקחיים קנס ביד שמאל ולהשתמש 27 מזרק מחט מד מצורף מזרק 1 סמ&quot;ק ביד ימין כדי להסיר את העור המת בקצה הקדמי של גולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט מעט גולם עם מלקחיים כראש עולה 27 להשתמש מחט מד לנתק את הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה של מחט או מלקחיים, העברת ראש טיפת לנתח פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עד שיש לך 10-15 ראשי בטיפה אחת. </li></ol> V. הסרת המוח מהראש תחת מיקרוסקופ לנתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד כל אחד להחזיק מזרק 1 סמ&quot;ק עם מחט מד 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אלה לתפקיד ראש לטוס ירידה של ביתור פתרון כל כך חוטם פונה אליך את פני השטח הגבי של הראש הוא בצפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט שמאלה אל חוטם כדי להצמיד את הראש למטה ולהשתמש מחט הזכות לבצע חתך בעין ימין העובר מן הגחון אל פני השטח הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט ממש ליד שמאל באזור חוטם ולאחר מכן להשתמש במחט משמאל בעדינות לדכא את הקוטיקולה מעל העין השמאלית, דוחפים את המוח לכיוון החריץ בעין ימין. המוח צריך לצאת מן חריץ בצד ימין, ללא פגע יחסית, לעתים קרובות עם שני lo אופטייםBES עדיין מחוברת ולפעמים רקמת העין פיגמנט גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את המוח על גבו של המחט ולהעביר לירידה של תמיסת מלח סטרילית לנתח בצלחת חדש סטרילי, 35 מ&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 10-15 מוחות עבור כל גנוטיפ. </li></ol> VI. הסרת אונות אופטיים וטיפול אנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד כל אחד להחזיק מזרק 1 סמ&quot;ק עם מחט 27 מד ולהשתמש אלה כדי לאסוף את כל המוחות בתחום אחד קטן של ירידה של פתרון לנתח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במזרקים כמו כלי חיתוך כדי להסיר את האונות אופטיים מהמוח כל כך את הרקמה הנותרת לתרבות הוא האזור במוח המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipetman 20 μl, נקבע μl 5, להעביר את כל במוחם של גנוטיפ יחיד צינור Eppendorf המכילה 1 מ&quot;ל של תמיסת papain סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח מודגרות ב papain במשך 10-15 דקות על קבוצה מסובב ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 3000 למשך 3 דקות. </li></ol> בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית סטרילי - כל השלבים שבו רקמה חשוף לאוויר צריך להיעשות ברדס זרימה למינרית עבור השלבים הנותרים. VII. כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון אנזים ולהחליף פתרון מנתחים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 3000 למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם פתרון לנתח סטרילי בסך הכל 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלוחים לנתח ולהחליף DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשטוף בסך הכל 2 פעמים עם DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מוח התקשורת מ&quot;מ צלחת פטרי סטרילית 35. </li></ol> VIII. טחינה דקה ו ציפוי תחת מיקרוסקופ לנתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 ul של DDM2 במרכז coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 המוח ירידה זו של DDM2 עם קצה צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למיקרוסקופ, להשתמש במחטים 27 מד אל הקוביות את המוח לחתיכות קטנות (צריך לקחת &lt;1 דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הדרכתו חזותיים, לשבור את קצה pipet כוס כי כבר משך לנקודה קנס כך חלקים גדולים יותר יכולים להישאב לתוך בעדינות קצה pipet וגורשו בחזרה לתוך המדיום. אנו משתמשים צינורות יניקה בפה כי מגיעות כסטנדרט עם זכוכית 100 המטוקריט μl נימי. הערה: הקפד לא לקבל בועות בתקשורת תצטרך אמפירי לקבוע את גודל pipet הטובה ביותר לשימוש. אלה טובים מאפשרים לך לנתק את המוח עם כמה תאים בודדים ועדיין כמה גושים גדולים, כ -30 שניות / המוח. כשאתה מסתכל על אלה בהספק גבוה יותר, כ 10-20% של נוירונים צריך עדיין יש כמה תהליכים שנותרו עדיין יהיו כמה גושים גדולים. אם לנתק יותר מדי, אז כל התאים יהיו עגולים יהיה להם נזק נגרם כל כך הרבה הם לא ישרדו. צעד זה דורש תרגול חייב להיעשות במהירות מאז יש יחס גדול משטח ל-נפח osmolality ו-pH של ירידה של DDM2 יכול להשתנות במהירות. רקמות צריך להיות ממוקם בתוך חממה CO 2 במהירות האפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוב על מכסה צלחת פטרי &quot;, גנוטיפ התאריך והשעה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את 35 מ&quot;מ צלחת פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ (עם kimwipe רטוב) ולתת להתיישב CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבול צלחת 35 מ&quot;מ עם 1.5 מ&quot;ל של DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תרבויות בחממה של 5% CO 2 באינקובטור (23 ° C). הערה: אם אין לך גישה ל-CO 2 באינקובטור קירור, השתמש תקן יונקים בתרבית רקמה החממה או לשים אותו בחדר חום קריר עד 23 ° C, או לשים במעבדה, לכבות זמני, ולהשתמש מגש קרח בחלק התחתון של החממה להסדיר זמני סביב הסביבה. </li></ol> IX. האכלה תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 (למחרת), להוסיף 0.5 מ&quot;ל של CNBM/B27 (Media אילף) כדי להפוך 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5 להחליף 1 מ&quot;ל של התקשורת 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תאים האכלה עם 03:01 DDM2: CNBM/B27 כל 4-5 ימים. הערה: תרבויות ניתן לגדל בלי הלא ממוזג אבל התקשורת העצבית הנוירונים נראים קצת שבירים יותר וקשה יותר לשימוש בניסויים electrophysiology. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1991).</li><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+behavioral+plasticity:+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System.">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li><li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium.">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li><li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons.">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li><li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors.">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li><li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells.">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li><li>Oh, H. -. W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture.">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li></ol>

נוירונים שנקטפו מן המוח של מכרסמים עובריים / לאחר הלידה ניתן לגדל בתרבית תאים העיקרי שבו הם להאריך neurites וליצור קשרים סינפטיים תפקודית. שיטות הכנה של תרבויות אלה מבוססים היטב מחקרים בתרבויות מכרסם העצבית יש תפקיד קריטי בזיהוי גנים וגורמים סביבתיים מעורבים ויסות היווצרות פונקציה סינפסה ו (הבנקאי Goslin, 1991). בעוד הנוירונים חרקים ממגוון רחב של מינים יכול להיות גם גדל בתרבות, הנוירונים חרקים רק הראו ליצור קשרים סינפטיים פונקציונלי בתרבות הם מן תסיסנית (Rohrbough et al, 2003). Neuroblasts שנקטפו אמצע gastrula שלב עוברים תסיסנית גדל מדיה מוגדר להצמיח נוירונים הם להתרגש חשמלית בצורה פונקציונלית, קשרים סינפטיים איטרניורונאליים (או &#39;דאוד, 1995; לי אודוד, 1999). כדי לזהות את הגורמים המווסתים צורה ותפקוד הסינפטי בנוירונים ידוע להיות מעורב בתיווך ההתנהגות הבוגרת פיתחנו את הטכניקה מאויר בסרטון הזה נוירונים קציר culturing מתוך מוחם של המנוח בשלב תסיסנית (סו ו אודוד, 2003). אחת התכונות המרכזיות של הליך זה היה להשתמש papain, במקום collagenase או אנזימים קשים אחרים המשמשים באופן מסורתי כהכנה תרבויות העצבית חרקים. תוצאות Papain בנוירונים ניתק שמירה על תהליכי axonal קצר לשרוד, להתחדש תהליכים מדלקת עצבים, וליצור קשרים סינפטיים איטרניורונאליים פונקציונלי. הקלטות שלמים אוכלוסיות תאים שזוהו, לרבות תאים בגוף פטריות קניון, מראים כי מהירות העברת סינפטיים מעוררים בתרבויות היא בתיווך nAChRs תוך עיכוב מתווכת קולטני GABA (סו ו אודוד, 2003). ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים האחרונות שלנו מוכיח כי נוירונים וסינפסות טופס תרבות עם תכונות מבניות הדומות הכימי והן סינפסות חשמליות במוח הבוגר (הו et al. 2007). כפי שמודגם בסרטון, תרבויות הם גם מקובל Fura-2 בדיקות הדמיה סידן השתמשנו אלה כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים הסלולר שינויים ספונטנית ועוררה רמות הסידן תאיים בתוך אוכלוסיות תאים המזוהים כולל תאים קניון ונוירונים cholinergic (ג&#39;יאנג et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. עם ערכת כלי מקיף הגנטי זמין תסיסנית מערכת זו תרבות מספק כלי מאוד שימושי עבור זיהוי הרגולטורים פנימי חיצוני של מבנה הסינפסה תפקיד מרכזי, ו הפלסטיות.

Coverslips לציפוי: לשים coverslips autoclaved בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ. 5 Pipet ul של קון תערובת / Laminin על מרכז coverslip כל אחד. מקום 37 C החממה למשך 2 שעות. לשטוף coverslips 3x עם ul 100 מים autoclaved כל אחד. השתמש ואקום המצורפת pipet פסטר סטרילית. במהלך השטיפה האחרונה, להרים את coverslip עם מלקחיים ויבש שני הצדדים. מעבירים את coverslip כדי בצלחת פטרי 35mm. אחסן בטמפרטורת החדר עד חודש.

primary neuronal cultures from the brains of late stage drosophila pupae

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת תרבויות העצבית העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. ההליך מתחיל עם סילוקו של מוחות מחיות ב 70-78 שעות לאחר היווצרות puparium. המוח מבודד מוצגים לאחר דגירה קצרה papain ואחריו שוטף מספר בינוני סרום ללא צמיחה. תהליך ניתוק מכני של המוח כל טיפה 5 ul של התקשורת על coverslip מודגם. האקסונים והדנדריטים של הפוסט mitotic הנוירונים התרחק ליד סומה במהלך דיסוציאציה אבל הנוירונים מתחילים מחדש תהליכים בתוך כמה שעות של ציפוי. תמונות להראות תרבויות לחיות 2 ימים. נוירונים להמשיך לפרט תהליכים במהלך השבוע הראשון בתרבות. אוכלוסיות נוירונים מסוימים ניתן לזהות בתרבות באמצעות GAL4 קווי לנהוג ביטוי רקמות ספציפיות של סמנים ניאון כגון GFP או RFP. הקלטות שלמות התא הדגימו את נוירונים בתרבית טופס פונקציונלי, סינפסות cholinergic ו GABAergic פעיל באופן ספונטני. קטע וידאו קצר ממחיש הדינמיקה סידן נוירונים בתרבית באמצעות Fura-2 כמו צבע אינדיקטור סידן לפקח הארעיים סידן ספונטנית ניקוטין התגובות סידן עורר בצלחת של נוירונים בתרבית. אלו תרבויות המוח גלמי הם מערכת מודל שימושי אילו כלים גנטיים תרופתי יכול לשמש כדי לזהות גורמים פנימיים וחיצוניים המשפיעים על היווצרות ותפקוד של סינפסות המרכזית.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae at JoVE.com

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Google

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  University of California, Irvine (UCI). וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.

Video: Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...