ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה שלנו, עצות שלהם דיונים והערות מועילות על כתב היד. אנו גם רוצים להודות במיוחד מרתה קוך באסם חסן על ההצעה מצוין כי אנחנו מחכים עד 1.5 שעות APF לפני לנתח מוחות עבור culturing בניסויים שיפוץ. כמו כן, אנו מודים מתקן הדמיה NHGRI לשימוש של מיקרוסקופ confocal שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית Neuroscience בסיסי של תוכנית המחקר NINDS המיפוי, NIH (Z01 NS003106).

א &#39;הכנת מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת שלמים על ידי בתוספת פילטר חיטוי תסיסנית שניידר מדיה עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקשורת יש להכין טרי בכל פעם. לחלופין, aliquot טרי מראש קפואים התקשורת ניתן להפשיר לפני כל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני culturing, להוסיף 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין ו 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ecdysone לתקשורת. סמים היו מוכנים כמו מניות מרוכזים ו קפוא aliquots קטנים. Aliquots מופשר לא היו refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות לכל העובדים יש לשמור על 25 ° C. </li></ol> Culturing של המוח הזחל 1. בחירה Dissection המוח הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של התקשורת כדי להוסיף 12 מ&quot;מ Millicell תרבית תאים. המוח גזור ימוקמו מוסיף אלה כדי להקל על immunostaining קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות קטנה של כלי התקשורת מוכנים זכוכית שעון לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uלשיר מרית קטנה, לאסוף את הנדודים 3 זחלים instar ומניחים אותם בזכוכית שעון. (אנו מניחים כי שיטת לשעבר התרבות vivo יחול באותה מידה על הזחלים instar 1 או 2, אבל לא צריך לבדוק את זה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הקצה האחורי של הזחל עם זוג מלקחיים, לפתוח בזהירות את הקצה הקדמי עם צמד של 2 # 5 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לנתח את המוח, שמירה על חוט העצב הגחון ללא פגע. </li></ol> 2. אקס culturing vivo של מוח הזחל גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מראש רטובים טיפים פיפטה, להעביר את המוח בזהירות לתוך התרבות מוסיף סלולריים, מראש מלאים התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח ההעברה, בכלי התקשורת, וכלה בחממה של 25 מעלות צלזיוס עד השעה הרצויה נקודות הוא הגיע. שיטה זו פועלת ביעילות של עד 48 שעות בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המדיה בכל 8 שעות. מעבר לכך, להחליף מחצית התקשורת כל 5-6 שעות. </li></ol> 3. מניפולציה תרופתי שלהזחל המוח שיטה זו של culturing vivo לשעבר יכול לשמש כדי לאשש פרמקולוגית אינטראקציות גנטיות הוכיחו בעבר במעבדה שלנו 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף roscovitine 100 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר olomoucine למדיה מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוחות מנתחים את זה בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות המוח במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המדיה בכל 8 שעות. מעבר לכך, להחליף מחצית התקשורת (עם סמים) כל 5-6 שעות. </li></ol> Culturing של המוח גלמי 1. מבחר גלמים לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן גלמים לבן על בקבוקים / צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לבחור גלמים כי הן לבנות לחלוטין. גלמים עם כל סוג של צבע לא צריך להיות כלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב זה הוא 0 שעות לאחר כינונה Puparium (APF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלמים אלה יהיו מוכנים לנתיחה 1.5 שעות לאחר סימון. שלב זה הוא חיוני כדי להבטיח כי גיזום התפתחותית מתרחשת לשעבר vivo </eמ &#39;&gt; תרבות. </li></ol> 2. דיסקציה של גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של התקשורת כדי להוסיף 12 מ&quot;מ Millicell תרבית תאים. (את המוח גזור ימוקמו מוסיף אלה כדי להקל על immunostaining קל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזמן הרצוי נקודות הושג, להוסיף כמות קטנה של כלי התקשורת מוכנים זכוכית שעון לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית קטנה, רטוב, לאסוף גלמים סימנה בעבר לנתיחה ומניחים אותם בזכוכית שעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הקצה האחורי של גלמים עם זוג מלקחיים, בזהירות לפתוח את סוף הקדמי של המארז גולם עם זוג נוסף של מלקחיים # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לנתח את המוח, שמירה על חוט העצב הגחון שלם המצורף. </li></ol> 3. אקס culturing vivo של מוח גלמי גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המוח בזהירות לתוך התרבות מוסיף סלולריים, מראש מלאים התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוח, בכלי התקשורת, וכלה בחממה של 25 ° C עד השעה הרצויה-Point הוא הגיע. השתמשנו בשיטה זו עד 10 שעות בתרבות לצורך הניסוי הראו, אך ניתן להרחיב את תקופות ארוכות יותר של התבוננות וטיפול, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפעם נקודות יותר APF 8 שעות, במקום כל 5-6 שעות מדיה. </li></ol> משלב זה ואילך, פרוטוקול נותר ללא שינוי על זחלים וגלמים הן. ב תיקון המוח גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזמן הרצוי נקודות הוא הגיע, להסיר התקשורת ולהוסיף 500 μl של פורמלדהיד 4% 1x PBS עם 0.5% טריטון X-100 (PBST) במשך 30 דקות, להחליף עם פורמלדהיד חדש לאחר 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שלא לאפשר מוחות להתייבש תוך החלפת התקשורת עם מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פורמלדהיד עם ארבעה שוטף 10 דקות של 1x PBS עם 0.5% TritonX-100 (PBST). </li></ol> ג מכתים המוח קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פורמלדהיד כבר לשטוף, לחסום את המוח במשך שעה 1 בפתרון חסימת 1x PBS עם 1% רגילעיזים סרום ו - 1% אלבומין בסרום שור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים ראשוניים שנעשו בתוך חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח דגירה לינה 4 מעלות ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לשטוף נוגדנים ראשוניים עם ארבעה 10 שטיפות זעירות של PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים משני מורכב לבלום פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו בטמפ &#39;החדר למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נוגדנים משני עם ארבעה 10 שטיפות זעירות של PBST. </li></ol> ד הרכבה המוח קבוע ומוכתמת מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן המוח בתקשורת Vectashield גובר שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המוח על שקופיות הזכוכית באמצעות התקשורת Vectashield הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שבבי זכוכית בכל צד של המוח לפני הרכבה תלוש כיסוי. זה מונע את מוחם מלהיות מעוכה, תוך שמירה על מדגם דק מספיק כדי לסרוק את כל המטוסים מוקד במיקרוסקופ confocal. המוח היו בכיוון בערך על הרכבה כדי להקל על הצגת תכונות של עניין. במידת הצורךתמונות המוח היו מסתובבים עם תוכנת Imaris לספק תצוגה אופטימלית תיעוד ומדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוגרים מכסה מחליק עם הלק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מחליק מן האור. </li></ol> קולי נציג תוצאות איור 1 מציג פאנל של 3-instar המוח הזחל של (A) wild-type זבובים (ב &#39;) זבובים המבטאים נגזרת דומיננטי שלילי של Cdk5 (Cdk5DN) (Connell, קראולי et al., 2000). שניהם מביעים אקטין-GFP (ירוק) בנוירונים מגה גמא. כפי שתואר קודם לכן (Trunova et al., 2011), יש אזור של אקסונים הפרוקסימלי של wild-type נוירונים גמא זה לא יצליח לצבור אקטין-GFP, ובכך להופיע בתור &quot;אזור ברורה&quot; (, סוגר), ו fasciclin 2 חלבונים (אדום) מצטבר אקסונים רק עד גבול הגחון של אזור זה (קו אופקי לבן). קו מקווקו בלוח השלישי של איור 1 (א) מציין את המיקום של MB, המדגיש את המעשהב &quot;אזור ברורה&quot; והגבול הגחון שלה. אצל זבובי המבטאים Cdk5DN, אזור אקטין ברור התאור (ב &#39;) Fasciclin 2 (FasII) immunoreactivity מתפשט dorsally דרך אזור זה. (שימו לב למספרים משתנים של הפרויקט אקסונים FasII חיובי אופקית לאורך MB, אלה אינן רלוונטיות פנוטיפ). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. באמצעות השיטה שלנו culturing vivo לשעבר, התייחסנו wild-type זבובים עם שילוב של roscovitine ו olomoucine, מעכבי תרופתי של פעילות Cdk5. תרשים 2 מציג פאנל של 3-instar המוח הזחל של שליטה (A) תחת טיפול תרופתי (ב &#39; wild-type) זבובים. בדומה זבובים המבטאים מבנה דומיננטי שלילי Cdk5, המוח שטופלו Cdk5 מעכבי למשך 24 שעות, מראים ירידה אופיינית לאזור אקטין ברורה שינוי הגבול FasII (סוגריים מרובעים). קווים לבנים להראות המיקום של הגבול FasII wild-type. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. FiguRe 3 מציג סדרות נציג של הגופים תסיסנית פטריות של 0-10 שעות APF, שכותרתו עם קרום ממוקד mCD8-GFP (ירוק). בסוגריים מציינים את גביע, כלומר, את תחזיות הדנדריטים של MB. לקראת מטמורפוזה, אפשר לראות אקסונים מגה שזורמים dorso-ventrally בצרורות עבים, כמו גם &quot;אובך&quot; של אות ניאון הנובעים הדנדריטי ארבור צפופה (סוגריים). כך עולה לוח מוחות גזור ברגע המתאים. הערה גיזום של דנדריטים באזור שעליו הצביע הסוגריים, כך לפי 6-8 שעות APF, אובך של הדנדריטים האות נעלם (אם כי את האות axonal אינו מושפע). המוח בלוח ב נותחו ב 0 שעות APF, לפני הפנימית ecdysone ספייק (טרומן Riddiford, 2002), vivo לשעבר תרבותי כמצוין. אלה לא הראו גיזום ההתפתחותי של דנדריטים, אלא אות הדנדריטים נמשכת לאחר 10 שעות APF. כדי לעקוף זאת, גלמים מסומנים ב APF שעות 0, אך גזור על 1.5 שעות APF ותרבותיים. חלוניתאני מציג סדרה C מייצג של גופים אלה פטריות תסיסנית מ APF שעות 0-10. כמו הלא מתורבתים דגימות, האות הדנדריטים הוא בלתי ניתן לגילוי על ידי 8 שעות APF. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

<html> מניפולציות גנטיות כרוניות של מבנה ותפקוד רקמות, כולל מוטציות וביטוי transgenes, בדרך כלל ליצור שילוב של השפעות מיידיות ותוצאות עקיפות מאוחר זה יכול להיות מאוד קשה להיפרד. משלימים שיטות גנטיות עם פרמקולוגיה יכול להקל על החקירה כמובן זמן מאחורי פנוטיפ. כך, למשל, זה כבר גישה רב עוצמה לנתח את התרומה של מרכיבים שונים במהלך cytoskeletal spermatogenesis ב תסיסנית 10. בדוגמה הנוכחית, היא אפשרה לנו להראות שיש דרישה עיקשת על Cdk5 לשמור על המבנה של AIS ב תסיסנית. בניסויים אחרים, יש לנו גם הצלחה באמצעות תרופות אחרות היעד רכיבים סלולריים, לרבות קינאזות חלבון (אימטיניב), אקטין פילמור (cytochalasin, latrunculin ו jasplakinolide) ו microtubules (vinblastine ו טקסול). &quot;&gt; אקס שיטות ב vivo תרבות גם לאפשר ברזולוציה גבוהה ניתוח של הדינמיקה של תהליכים התפתחותיים. מחקרים קודמים תיארו לטווח קצר הדמיה חיה של המוח המרכזי 11, או לטווח ארוך הדמיה של חלקים אחרים של מערכת העצבים, כגון 12 הגרעינים החזה ואת הרשתית / קשרים באונה אופטיים 13. הנה, בעוד אנו מתמקדים בניתוח של הרקמה על ידי immunostaining של חומר קבוע, השיטה שאנו מתארים אמור לחול על הדמיה לטווח ארוך חי של המוח המרכזי. לדוגמה, גיזום נכון של אקסונים דנדריטים במהלך ההתפתחות של הגוף פטריות תסיסנית חיוני יצירת קשרים נכונים ודפוסי בעצםב במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, ליקויים בארגון שיפוץ העצבית והם חשבו בבסיס מחלות ניווניות שונות, כולל אלצהיימר, ALS ופרקינסון. השיטה המתוארת כאן מאפשר לנו לחקות ב<html> vivo שיפוץ של neurites ב vivo הגוף פטריות תסיסנית לשעבר, בתרבות. אנחנו יכולים עכשיו שינויים תמונה בפיתוח בתגובה שינויים גנטיים, טיפולים תרופתיים או שינויים בסביבה. <img src="/files/ftp_upload/4270/4270fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. יתר ביטוי Cdk5DN גורם לאובדן של &quot;אזור ברורה&quot; אקטין שינוי הגבול FasII in-נוירונים גמא של הגוף פטריות תסיסנית. לוח מראה שלוש דוגמאות של wild-type המוח מוכתמים של אקטין-GFP (ירוק) ו FasII (אדום) תוך לוח ב &#39;מראה שתי דוגמאות של המוח יתר המבטאים Cdk5DN. הערה אובדן &quot;אזור ברורה&quot; אקטין (סוגריים) ולהעביר בגבול FasII הגחון (קו לבן אופקי) ב (B). קו מקווקו ב (א) מציין את מיקומו של גוף הפטרייה. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. 2 &quot;/&gt; איור 2. טיפול תרופתי Cdk5 מעכבי roscovitine ו olomoucine מחקה Cdk5DN יתר ביטוי פנוטיפ בגופים תסיסנית פטריות. לוח מראה שני wild-type המוח בקרה תוך לוח B מראה שתי תחת טיפול תרופתי המוח, בתרבית למשך 24 שעות. הערה אובדן &quot;אזור ברורה&quot; אקטין (סוגריים) ו שינוי גבול FasII (קו לבן אופקי) ב (B). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/4270/4270fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. בשיפוץ vivo של דנדריטים של הגוף דנדריטים פטריות תסיסנית ניתן לחזור בדיוק vivo לשעבר. לוח מראה המוח גזור בנקודות הזמן שצוין ומוכתם של ה-GFP קרום הנכנס (ירוק). הערה היעלמותו של האות הדנדריטים (האות מפוזר, ירוק, מודגשת על ידי המסגרת) על ידי 8hr APF. לוח ב &#39;מראה המוח גזור ב 0 שעות APF ו vivo לשעבר תרבותי </em&gt; על פי המצוין. גיזום לא של דנדריטים נראה, כפי לפחות מאוחר ככל 10 שעות APF על ידי התמדה של הדנדריטים (ערפל ירוק, סוגר). לוח ג מראה המוח גזור על APF 1.5 שעות, בעקבות הפנימי ecdysone ספייק, ו vivo לשעבר תרבותית לזמנים שצוינו. מוחות אלו מראים גיזום דנדריט דומה לזה ראיתי in vivo (א &#39;). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> שניידר תסיסנית מדיה </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית (חום מומת) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdysone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> עיזים רגיל סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> שור אלבומין בסרום </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP151 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H1000 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> תרבות Millicell סלולריים הוספת </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 גם </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

אנו מתארים שיטה culturing vivo לשעבר של שלמות המוח תסיסנית. זה יכול לשמש משקל נגד כדי מניפולציות גנטיות כרוניות על חקירת ביולוגיה של התא ופיתוח של מבנים מוחיים מרכזיים בכך שהוא מאפשר התערבויות תרופתיות חריפות הדמיה חיה של תהליכים תאיים. כדוגמה טכניקה, לפני לעבוד במעבדה שלנו 1 הראה כי תא subcellular מוכרים קודם לכן נמצא בין התאים axonal ו somatodendritic של אקסונים במוח תסיסנית המרכזית. הפיתוח של תא זה, המכונה במגזר האקסון הראשון (AIS) 2, הוצגה גנטית תלוי קינאז נוירון ספציפי cyclin תלוי, Cdk5. אנחנו מראים כאן כי טיפול vivo לשעבר של wild-type המוח תסיסנית הזחל עם Cdk5 ספציפי מעכבי תרופתי roscovitine ו olomoucine 3 גורמת לשינויים חריפים בארגון אקטין, ובלוקליזציה של חלבונים על פני קרום התא Fasciclin 2, המחקים את השינויים הנראים מוטנטים חסרי Cdk5 פעילות גנטית. דוגמה 2 של הטכניקה vivo לשעבר התרבות מסופק שיפוץ של קשרים של הגוף פטריות עובריים (MB) נוירונים גמא במהלך המטמורפוזה של הזחל לבוגר. גוף הפטרייה הוא מרכז למידה חוש הריח וזיכרון זבוב 4, אלה הנוירונים גמא לגזום ענפים axonal ו הדנדריטים שלהם במהלך פיתוח גלמי ואז שוב להאריך סניפים בכל timepoint מאוחר יותר לקבוע את דפוס העצבוב מבוגרים 5. גיזום של נוירונים אלה של MB הוכח להתרחש באמצעות ניוון המקומי של הענפים neurite 6, על ידי מנגנון זה מופעלת על ידי ecdysone, הורמונים סטרואידים, הפועל על הקולטן ecdysone B1 7, וכי היא תלויה בפעילות של ubiquitin-הפרוטאזום המערכת 6. השיטה שלנו של culturing vivo לשעבר יכול בדואר רגיל לחקור עוד יותר את המנגנון של שיפוץ התפתחותית. מצאנו כי הגדרת vivo לשעבר התרבות, הנוירונים גמא של MB סיכמו את תהליך גיזום התפתחותית כמובן עם הזמן בדומה in vivo. זה היה חיוני, עם זאת, לחכות עד 1.5 שעות לאחר היווצרות puparium לפני explanting את הרקמה על מנת התאים להתחייב באופן בלתי הפיך על מטמורפוזה, דיסקציה של בעלי חיים עם תחילת pupariation הוביל מטמורפוזה קטנה או לא בתרבות. לכן, עם שינויים מתאימים, גישה לשעבר התרבות vivo ניתן ליישם ללמוד דינמי כמו גם היבטים למצב יציב של הביולוגיה מוח מרכזי.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לחקות<em&gt; In vivo</em&gt; פיתוח<em&gt; תסיסנית</em&gt; פטריות הגוף<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; מערכת התרבות.

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

13.0K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לחקות In vivo פיתוח תסיסנית פטריות הגוף לשעבר vivo מערכת התרבות.

Video: Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

יישור פיברגרם OCT של רשתית העכבר עם תמונות קונפוקליות

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

מחבר זרקור: התקדמות בהדמיית הרשתית In Vivo ו- Ex Vivo לשיפור אבחון וטיפול בגלאוקומה 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

הבנת תגובות נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

מחבר זרקור: קידום גירוי חוט השדרה - חקר התגובות התאיות של נוירונים מוטוריים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...