כדי להתחיל, חיסון Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ממלאי גליצרול לשישה מיליליטר של מרק דה מאן, רוגוזה, שארפ או MRS, בצינור של 50 מיליליטר. דוגרים על התרבית באופן אירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי. למחרת, חסנו ארבעה מיליליטר של תרבית הלילה לתוך 200 מיליליטר של מרק MRS.
אפשרו לתרבית לגדול באופן אירובי באינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר תגיע ל-0.5 עד 0.85. לאחר מכן, רוקנו את התרבית לצינורות צנטריפוגות 50 מיליליטר והניחו אותם על קרח תוך איזון הצינורות. צנטריפוגות את התרבות בצנטריפוגה מצוננת מראש ומשליכות את הסופרנטנט.
לפני השעיית הגלולה ב-50 מיליליטר מים מזוקקים כפולים מצוננים, חזרו על הצנטריפוגה פעמיים. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, להשהות מחדש את הגלולה ב 25 מיליליטר של מים מזוקקים כפול, 0.5 סוכרוז טוחן, ו 10% גליצרול. צנטריפוגו את תרחיף התא, השליכו את הסופרנטנט והשהו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר מים מזוקקים כפול, 0.5 סוכרוז טוחן, ו-10% גליצרול על קרח.
יש להכניס את התרחיף למנות של 50 עד 100 מיקרוליטר בצינורות מיקרוצנטריפוגות מקוררות מראש ולאחסן את הצינורות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, עבור electroporation, להפשיר aliquot של תאים electrocompetent על קרח. מערבבים חמישה עד 10 מיקרוליטרים של פלסמיד לתוך aliquot מופשר הימנעות pipetting ככל האפשר.
מעבירים את התערובת לקובט אלקטרופורציה מקורר ברווח של מיליליטר אחד ואלקטרופורטים במתח של 1.25 קילו-וולט, 400 אוהם ו-25 מיקרופאראדות. לאחר ההתחשמלות, מוסיפים מיליליטר אחד של ציר MRS ומערבבים על ידי היפוך הקובט פעם או פעמיים. הכניסו את הקובטות לאינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 עד שלוש שעות להתאוששות.
לאחר מכן, לוחית את כל המתלים על מספר לוחות אוגר MRS עם בחירה מתאימה. מניחים את הצלחות בתוך מיכל אטום עם נר דולק קטן באווירה אנאירובית המייצרת שקית. גדל ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים-שלושה או עד הופעת מושבות גלויות.
אלקטרופורציה של L.reuteri עם mCherry2 מכונן המייצר פלסמיד pTRKH3 נותן יעילות טרנספורמציה של בערך חמש עד שמונה מושבות לכל 200 מיקרוליטר מצופה ללא קשר למצב מתילציה פלסמיד. טרנספורמציה עם pNZ123 ללא חלבון מכונן אקסוגני הניבה יעילות טרנספורמציה של פי שלושה פי 10 לארבעה CFU למיקרוגרם DNA.
