מדידת גודל נקבוביות וניתוח פיזור תאים של פיגומים תפוחים שמקורם בתאים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי

כדי להתחיל, לשטוף את פיגומים תפוחים decellularized עם פוספט buffered מלוחים. למדידת גודל הנקבוביות, דגרו על הפיגומים במיליליטר אחד של תמיסה לבנה 10% קלקופלור למשך 25 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הפיגומים עם PBS, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי במהירות גבוהה והגדר את תצורת מסנן פליטת הלייזר.

כוונן את עוצמת הלייזר ואת הגלאי באופן ידני כדי להבטיח קבלת תמונה מיטבית. קבל ערימת Z של 20 תמונות עם גודל צעד של חמישה מיקרומטר. בשלב הבא בתוכנת ImageJ, השתמש בפונקציית פרויקט Z לעוצמה מרבית כדי ליצור תמונה ולהחיל את פונקציית חיפוש הקצוות כדי להדגיש את קצה הנקבוביות.

עקוב אחר הנקבוביות באופן ידני באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית. התאימו כל נקבובית כאליפסה ומדדו את אורך הציר הראשי. ערכו את כל המדידות וחשבו את האורך הממוצע.

לניתוח התפלגות התא, לאחר שטיפת פיגומים זרעי תאים בתרבית במדיום המתאים שלוש פעמים עם PBS, לתקן אותם עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו היטב כל פיגום במים נטולי יונים, חדרו את התאים בתמיסת Triton X-100 למשך חמש דקות ושטפו שוב עם PBS. יש לדגור על הפיגומים במיליליטר אחד של חומצה מחזורית 1% למשך 40 דקות ולשטוף במים נטולי יונים.

לאחר מכן לדגור על הפיגומים על ידי טבילתם לחלוטין במיליליטר אחד של תמיסת צביעה. שטפו את הפיגומים עם PBS והכתימו את גרעיני התא על ידי דגירה על הפיגומים בתמיסת DAPI של חמישה מיליגרם למיליליטר למשך 10 דקות בחושך. שטפו שוב ביסודיות ואחסנו את הפיגומים ב-PBS.

צלם את הפיגומים מזרעי תאים במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי במהירות גבוהה בהגדלה של פי 10 באמצעות ההגדרות המוצגות כאן. כוונן את עוצמת הלייזר ואת הגלאי באופן ידני כדי להבטיח קבלת תמונה אופטימלית וקבל ערימת Z של 20 תמונות עם גודל צעד של חמישה מיקרומטר. לאחר מכן השתמש בתוכנת ImageJ כדי לעבד את התמונות הקונפוקליות והשתמש בפרויקט Z לפונקציית עוצמה מקסימלית כדי ליצור הקרנה מקסימלית בציר z לניתוח תמונה.

כימות תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי הדגים התפלגות גודל נקבוביות בין 73 ל-288 מיקרומטר עם ממוצע של כ-154 מיקרומטר. רוב הנקבוביות נעו בין 100 ל-200 מיקרומטר. לאחר גידול במדיום ההבחנה, נצפו מרבצי מינרלים בפיגומים.

הפיגומים מזרע התא הציגו צבע לבן אטום המרמז על מינרליזציה, שלא נצפתה בפיגומים הריקים. יתר על כן, ניתוח מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי גילה פיזור תאים הומוגני בתוך הפיגומים.