הכנה וזריעת תאים של פיגומים תפוחים נטולי תאים

בתור התחלה, השתמשו בפרוסת מנדולינה כדי לחתוך תפוחי מקינטוש לפרוסות בעובי שמונה מילימטר. חותכים את רקמת ההיפנתיום של פרוסות התפוחים לריבועים של חמישה על חמישה מילימטר. הניחו את הדגימות המרובעות ב-0.1% SDS למשך יומיים כדי לבטל את הסלולריות.

לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מים deionized לדגור אותם לילה 100 מילימולרי סידן כלורי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לעקר פיגומים אלה באתנול 70% למשך 30 דקות. שטפו אותם במים נטולי יונים, והניחו אותם בצלחת תרבית בת 24 בארות.

לזריעת תאים, יש להשתמש בתת-שיבוט MC3T3-E1 של 4 תאים הנשמרים בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ שטופלו בתרבית בתנאים של תרבית תאים. הכינו גם מדיום תרבית תאים המורכב מאלפא MEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי או FBS ו-1% פניצילין בסטרפטומיצין. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, מנתקים אותם מכלי התרבית על ידי טריפסיניזציה.

צנטריפוגה את מתלה התא ב 200 גרם במשך שלוש דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים באלפא MEM. לאחר מכן, צינור של 40 מיקרוליטר aliquot של תרחיף התא על פני הפיגומים, ולתת לתאים לדבוק במשך שעה אחת בתנאי תרבית תאים.

לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של מדיום תרבות לכל תרבות היטב. לחדש את מדיום התרבות כל יומיים-שלושה במשך 14 ימים. לאחר 14 יום, להכין מדיום התמיינות על ידי הוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של חומצה אסקורבית וארבעה פוספט נתרן מילימולרי למדיום תרבית התא.

הוסיפו את המדיום הזה לצלחת התרבות. לדגור על הפיגומים במשך ארבעה שבועות כדי לגרום להתמיינות של תאי MC3T3-E1, ולחדש את התווך כל שלושה עד ארבעה ימים.