Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

כדי להתחיל, מערבבים את תרחיף מח העצם המבודד עם מתלה חריף העצם. פיפטה 10 מיקרוליטר של תרחיף התא על hemocytometer לספירה. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 100 מיקרוליטר של חיץ FACS. כדי להכתים את התאים בנוגדנים לדלדול מגנטי, הוסף בלוק FC, APC CD45 ו- APC TER-119. לאחר מכן שטפו את מתלה התא עם מאגר FACS.

לאחר צנטריפוגה של התערובת הנותרת, להשהות מחדש את הגלולה ב 100 מיקרוליטר של חיץ FACS. כדי להכתים את תרחיף התא במיקרו-כדוריות לדלדול מגנטי, הוסיפו מיקרו-כדוריות מסוג IgG של העכבר ומיקרו-חרוזים נגד APC. דוגרים על התערובת על קרח במשך 20 דקות.

שטוף את עמודת LD עם שני מיליליטר של מאגר MACS. השהה מחדש את התאים במאגר, ולאחר מכן סנן אותו דרך מבחנה של חמישה מיליליטר עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר. לאחר מכן, הגדר את עמוד LD על מעמד המפריד המגנטי והנח מבחנה של חמישה מיליליטר מתחת לעמודה כדי לאסוף את החומר המדולל.

פיפטפו את תרחיף התא לעמודת LD ואספו את זרימת השבר השלילי במבחנה. שטפו את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ MACS ואספו את החומר המרגיע באותו צינור. הניחו את עמודת LD מעל מבחנה חדשה של חמישה מיליליטר.

בעזרת פיפטה, יש לפזר שלושה מיליליטר של חיץ לתוך העמודה, ולאחר מכן לשטוף את התאים המסומנים באופן חיובי לתוך מבחנה של חמישה מיליליטר. צנטריפוגה הן את השברים החיוביים והן את השליליים, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 100 מיקרוליטר של חיץ FACS. כדי להכתים את החלק השלילי CD45 TER-119 להוסיף מיקרוליטר אחד של כל נוגדן לכל 10 לתאים השישיים.

מניחים את המתלים על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן שטפו את המתלה עם שני מיליליטר של חיץ FACS לפני הצנטריפוגה. הוסף מיליליטר אחד של החיץ לגלולה ופיפטה פרופידיום יודיד לצביעת תאים חיים.

לבסוף, סנן את הדגימה דרך מסננת תאים של 35 מיקרומטר לתוך מבחנה של חמישה מיליליטר לפני ניתוח התאים על ציטומטר זרימה צבעוני. תאי אנדותל עורקיים התרחבו באופן משמעותי במיקרו-סביבה של לוקמיה מיאלואידית חריפה עם אובדן במקביל באוכלוסיות האנדותל הסינוסואידלי. התרחבות קטנה בתאי הסטרומה המזנכימליים נצפתה בגיל שמונה שבועות.