טרנספקציה, בידוד וסינון של תאי HeLa בנוקאאוט CENP-E

כדי להתחיל, להוסיף 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA לתאי HeLa ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד שלוש דקות. נתקו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג וזרעו אותם בצלחות חדשות ביחס של אחד עד ארבעה למעבר תאים. כדי להדביק את הפלסמיד לתאי HeLa, ערבבו מיקרוגרם אחד של פלסמיד PX458 sgRNA מאומת, עם 50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור A.In צינור B, ערבבו בעדינות שני מיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה ו-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ודגרו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

לאחר מכן, ערבבו את התוכן מצינוריות A ו-B ודגרו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות נוספות. מוסיפים את התערובת לצלחת בת 12 הבארות ודגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. בסוף הדגירה, להחליף את המדיום עם מדיום DMEM טרי.

לאחר 24 או 48 שעות, להעריך את יעילות transfection על ידי בחינת תאי HeLa תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נתק את תאי HeLa הנגועים במלואם באמצעות 0.25% טריפסין EDTA ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר או מונה תאים אוטומטי.

לוחמו את התאים לשלוש צלחות נפרדות בנות 96 בארות עבור כל אוכלוסייה נגועה בשיטות דילול סדרתי. להחזיר את התאים לאינקובטור לח למשך שבוע עד שבועיים. עבור סינון מבוסס פנוטיפ ואימות של CENP-E Knockout, לנתק ולהרחיב את התאים בלוחות 24 באר או 12 בארות במשך חמישה עד שבעה ימים.

מסך את התאים המוטנטיים בקוטר מושבה קטן יותר באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשות אובייקטיביות בהגדלה של פי 10 ופי 20. לאחר מכן, קצרו את התאים למיצוי DNA על ידי שימוש בערכת מיצוי הדנ"א הגנומי של Column Animal בהתאם להוראות היצרן והגדירו את תגובות השרשרת של פולימראז. קשר את DNA המטרה לתוך וקטור pMD18-T בהתאם להוראות הפרוטוקולים של היצרן.

החלף את הפלסמיד הקשור לתאי DH5-Alpha מוכשרים, והמשך עם התרבית לבחירת שיבוט. כדי לזהות את סוגי CENP-E Knockout, בודד את DNA הפלסמיד בעזרת ערכת מיצוי פלסמיד בהתאם להנחיות היצרן. לאחר מכן, בצע ריצוף סנגר עבור DNA פלסמיד של כל מושבה באמצעות M13 קדימה ואחורה פריימרים.

זרעו את תאי HeLa המוטנטיים מסוג פרא ו-CENP-E על פתקי כיסוי זכוכית בקוטר 12 מ"מ בצלחת בעלת 24 בארות. הסר את מדיום DMEM המלא ותקן את התאים באמצעות תמיסת 4% paraformaldehyde ו- PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכתימו את הגרעינים עם DAPI בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

התבוננו ואמתו את התאים המוטנטיים CENP-E בהתבסס על פנוטיפ יישור הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הסינון הפנוטיפי של המושבות הראה כי תאי הנוקאאוט CENP-E הראו חוסר התאמה מוגבר של הכרומוזומים בהשוואה לקבוצת הביקורת.