יצירת Protein-E CENP-E-^/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

561 Views

•

11:49 min

•

June 23rd, 2023

DOI :

10.3791/65476-v

June 23rd, 2023

•

Meng-Fei Xu¹^,², Jie Chen¹^,², Yue Xu¹^,², Jing-Lian Zhang¹^,², Yi Zhou¹^,², Jie-Jie He¹^,², Shan Wu¹^,², Ya-Lan Wei³^,⁴, Zhen-Yu She¹^,²

¹Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, ²Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, ³College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, ⁴Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Transcript

מחיקה גנטית של קינזין-7 ו-CENP גורמת בדרך כלל למעצר מחזור התא ולמוות תאי. בניית קווי תאי נוקאאוט יציבים של CENP היא סוגיה חשובה ולא פתורה בביולוגיה של CENP. במחקר זה, יצרנו תאי HeLa בנוקאאוט CENP באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, וביססנו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות.

לאחרונה, מספר טכנולוגיות לעריכת גנומים, כולל נוקלאזות אצבע אבץ, נוקלאזות אפקט דמויות מפעיל שעתוק, וכיצד אנו מייצרים את הנוקלאזות שלנו, הונדסו כך שיבקעו גנומים בגודל מסוים. טכנולוגיית נוקאאוט הגנים CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה בביולוגיה, ביוטכנולוגיה ורפואה בסיסיות. CENP חיוני לחיבור קינטוכורים למיקרוטובולים ויישור כרומוזומים.

שיבוש CENP, בין אם באמצעות מיקרו-הזרקה של נוגדנים, מחיקת sgRNA, עיכוב כימי או מחיקה גנטית, גורם לחוסר תיאום כרומוזומים, פגמים מיטוטיים, ולעתים קרובות מוות תאי, מה שמסבך את המחקר של מנגנוני חלבון CENP. במחקר זה נקבעו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות מבוססות פנוטיפ, כולל סינון מושבות תאים, יישור כרומוזומים של פנוטיפים ועוצמות פלואורסצנטיות של חלבוני CENP, אשר שיפרו את יעילות הסינון ואת שיעור ההצלחה של הניסוי. חשוב לציין, מחיקת CENP גורמת לחוסר התאמה של כרומוזומים, מיקום לא תקין של חלבוני BubR1 ופגמים מיטוטיים.

אופני האינטראקציה והמנגנונים המולקולריים של CENP ומעכביו הם תחומי מחקר חשובים בביולוגיה של התא ובחקר הסרטן. במחקר זה, קו תאי HeLa בנוקאאוט CENP נקבע ככלי רב ערך לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP.

Summary

Explore More Videos

196

CENP E

BUB1 B BubR1

Chapters in this video

0:00

Introduction

2:16

Transfection, Isolation, and Screening of the CENP‐E Knockout HeLa Cells

6:25

Immunofluorescence Staining and High‐Resolution Confocal Microscopy of CRISPR/Cas9‐Mediated CENP‐E Knockout HeLa Cells