אפיון ננו-חיישנים ובדיקת סמן ביולוגי מתווך בשתן CRISPR-Cas לאבחון סרטן

כדי להתחיל, להמיס שני מיליגרם של PEG רב-ערכי עם קבוצה תגובתית maleimide, ומיליליטר אחד של 100 מילימולר פוספט buffer. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. הוסף את הציסטאין סיים DNA פפטיד מצומד לתמיסה.

השתמש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להסיר את החומרים הבלתי מצומדים. הפעל את הדגימות ב- PBS. עקוב אחר ספיגת ה- DNA והפפטידים.

מניחים את הדגימה בצינורות המסנן הצנטריפוגלי ומרכזים את הננו-חיישנים המסונתזים באמצעות צנטריפוגה בהתאם למהירות המומלצת של היצרן. השתמש צלחת 96 באר כבסיס עבור תא דיור מותאם אישית. כדי לאסוף את השתן למדידות בסיסיות, הניחו תחילה עכבר בתא הדיור.

הפעל לחץ עדין על שלפוחית השתן של העכבר המאופק כדי לסלק את שאריות השתן על הצלחת. פיפטה את השתן שנאסף לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הכינו 200 מיקרוליטר של תמיסת הזרקת ננו-חיישנים ב-PBS סטרילי.

תוך ורידי להזריק 200 מיקרוליטר של הפתרון לתוך כל עכבר. לאחר שעה של הזרקה, לאסוף את דגימות השתן מן עכברי הביקורת והניסוי. לזיהוי CRISPR מבוסס פלואורסצנטיות של ברקודי DNA, צנטריפוגו את דגימות השתן ב-800 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כעת ערבבו את ריאגנטי הקריספר, ולאחר מכן הוסיפו את האנזים Cas12a לפני שתקפצו בעדינות את תערובת התגובה מעלה ומטה. לדגור על תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן הפעל את תגובת הכתב באמצעות תערובת ה- DNA של הכתב המבוססת על FRET.

מוסיפים את התערובת לצלחת של 384 בארות ומיד מודדים את הפלואורסצנטיות ב 37 מעלות צלזיוס כל שתי דקות במשך שלוש שעות כדי לפקח על קינטיקה המחשוף. כדי לבצע זיהוי CRISPR מבוסס נייר, הפעל תגובת כתב חלופית לאחר הדגירה של תגובת CRISPR באמצעות כתב FAM-Biotin המסומן ככתב DNA. לאחר שילוב ריאגנטים לתוך צלחת 96 באר, לכסות אותו עם רדיד אלומיניום, ולאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

עכשיו להוסיף 80 מיקרוליטר של PBS לתוך באר טרייה של צלחת 96 באר. פיפטה 20 מיקרוליטר של תגובת כתב תערובת לתוך הבאר הזאת. מניחים פס נייר זרימה רוחבי לכל באר, וממתינים עד שהנוזל מגיע לחלק העליון של הרצועה.

הדנ"א החד-גדילי שעבר שינוי כימי הדגים הפעלת Cas12a ביחס לדנ"א הדו-גדילי שלא עבר שינוי ולדנ"א חד-גדילי חד-גדילי. מולקולות דנ"א מעובדות בשתן לא מעובד הראו קריאה קולורימטרית על רצועות נייר זרימה רוחבית. רצועת הדגימות המובילה הצביעה על שחרור FAM ניתן לזיהוי דרך מחשוף הכתב המופעל על ידי DNA של השתן.