מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה של מכון קוך מספר P30-CA14051 מהמכון הלאומי לסרטן (מרכז סוונסון לביוטכנולוגיה), מענק מרכז ליבה P30-ES002109 מהמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, מרכז מרבל לננו-רפואה של סרטן במכון קוך, תוכנית מחקר הגבולות של מכון קוך באמצעות קרן קתי וקורט מארבל לחקר הסרטן, וקרן וירג'יניה וד.ק. לודוויג לחקר הסרטן. A.E.V.H. נתמך על ידי מלגת הכשרה קדם-דוקטורנטית במימון NIH (T32GM130546). S.N.B. הוא חוקר במכון הרפואי הווארד יוז. L.H. נתמכת על ידי K99/R00 Pathway to Independence Award מהמכון הלאומי לסרטן ומימון סטארט-אפ מאוניברסיטת בוסטון.

כל המחקרים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד המחברים. מתקנים סטנדרטיים לטיפול בבעלי חיים, כולל תאי דיור, ברדסים סטריליים, הרדמה והמתת חסד אתית נדרשים כדי לבצע ניסויים אלה כראוי. כל הניסויים נערכים בהתאם להנחיות מוסדיות וארציות ובפיקוח הצוות הווטרינרי במוסד. נקבות עכברי BALB/c, המשמשות לניסויים, מתקבלות ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים) וגילן נע בין 6 ל-8 שבועות בתחילת המחקר. רצפים עבור DNA מסונתז בהתאמה אישית, crRNA, בדיקות מצע פפטידי מבוסס FRET, ופפטידים חיישנים מסופקים בטבלה משלימה 1.
1. בחירת מצע פפטידי המופעל על ידי פרוטאז
<ol><li>לאסוף ולהכין דגימות רקמה מרקמת ריאה או ריאה בריאה עם גושים סרטניים בעקבות דוחשפורסם בעבר 13.<ol><li>הומוגניזציה של רקמות במי מלח חוצצים פוספט מקורר מראש (PBS, pH 7.4) (200 מ"ג רקמה/מ"ל PBS) עם צינורות דיסוציאציה של רקמות לדיסוציאציה אוטומטית של רקמות לתרחיפים חד-תאיים.</li>
		<li>רקמת הצנטריפוגה הומוגנטית ב 6,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant בצינור חדש.</li>
		<li>צנטריפוגה את supernatant ב 14,000 x גרם במשך 25 דקות ב 4 ° C.</li>
		<li>מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון של חומצה ביכומונית (BCA) (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>הוסף PBS למדגם כדי להכין תמיסת 0.33 מ"ג / מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>הערך את הפעילות הפרוטאוליטית לפי השלבים הבאים.<ol><li>בצלחת של 384 בארות, הוסיפו 5 μL, 6 μM מצע פפטידי מבוסס FRET לכל באר. עבור כל בדיקה, לבצע את התגובה משולשת. הערה: בדיקת מצע פפטיד מבוססת FRET מכילה רצף פפטידי קצר (6-8 חומצות אמינו, שנועד להיות ספציפי לפרוטאז מטרה או לקבוצת פרוטאזות) המסתיים בזוג פלואורופור ומרווה (quencher). שתי בדיקות FRET מתוארות בטבלה משלימה 1 כדוגמה. את הספרייה המלאה של הגשושיות ניתן למצוא ב- Hao et al.13.</li>
		<li>צנטריפוגו את צלחת הבאר במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר ב 180 x גרם כדי להבטיח את הגשושיות בתחתית הצלחת.</li>
		<li>הוסף 25 μL 0.33 מ"ג / מ"ל דגימת רקמה או 40 מיקרומטר פרוטאז רקומביננטי13 לכל באר. הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את הריכוז הסופי של דגימת הרקמה או הפרוטאז הרקומביננטי בהתאם לפעילות הפרוטאוליטית הפנימית שלהם. לדוגמה, רקמות פרוטאוליטיות מאוד כגון מעיים עשויות לדרוש גורמי דילול גבוהים יותר כדי לאפשר ניטור של שסע אנזימטי ראשוני.</li>
		<li>צנטריפוגה את צלחת הבאר לזמן קצר ב 180 x גרם (בטמפרטורת החדר) כדי לערבב את הגשושיות ואת lysates רקמות.</li>
		<li>התחל מיד לזהות מחשוף בדיקה על ידי מדידת פלואורסצנטיות עם קורא הלוחות ב 37 ° C כל 2 דקות במשך 1 שעה (λex: 485 ננומטר; λem: 535 ננומטר) כדי לפקח על המחשוף. הערה: השתמש באורכי גל העירור והפליטה המתאימים לזוגות פלואורופורים ומרווה ספציפיים. במקרה של מחקר זה, פרמטרים (λex: 485 nm ו- λem: 535 nm) נקבעים עבור פלואורופור FAM.</li>
		<li>כדי לנתח את נתוני המדידה הפלואורסצנטיים, השתמש בחבילת Python (ראה טבלת חומרים) לניתוח קינטיקה של אנזימים הזמין ב- https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. סקריפט זה מחשב את מהירות התגובה הראשונית (V0) באמצעות שיפוע ההתאמה הליניארית של 8-10 נקודות הזמן ההתחלתיות הראשונות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ניסוח ואפיון חיישנים
<ol><li>לסנתז את הצמידות של DNA ופפטיד המופעל על ידי פרוטאז (PAP).<ol><li>לדגור על כתבי DNA פוספורותיו של 20 מר עם קבוצת 3'-DBCO (1.1 eq., ראה טבלת חומרים) עם PAPs עם סיום אזיד עם C-terminus ציסטאין מסתיים במאגר פוספט של 100 mM (pH 7.0) בטמפרטורת החדר למשך >4 שעות. אם עוזבים לילה, לדגור ב 4 °C (75 °F).</li>
		<li>לטהר את המוצר על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים המצוידת בטור אידיאלי לביומומולקולות (ראה טבלת חומרים). הגדר את שיפוע HPLC להתחיל ממאגר 5% A (0.05% TFA ב- H2O), לשמור איזוקרטי למשך 20 דקות ולהגיע למאגר 80% B (0.05% TFA, 99.95% אצטוניטריל) ב- 65 דקות עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל min-1, ואסוף את המוצר המצומד עם זמן שמירה ב~ 31 דקות.</li>
		<li>אמת את המצומדים המטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסות ספיחה בלייזר/זמן יינון טיסה (MALDI-TOF) בעזרת מטריצה באמצעות חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינאמית כמטריצה14 (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>סנתז ננו-חיישנים מבוססי פעילות המקודדים בדנ"א.<ol><li>יש להמיס 2 מ"ג של PEG רב-ערכי (40 kDa, 8-arm, ראו טבלת חומרים) עם קבוצה תגובתית maleimide ב-1 מ"ל של 100 mM חיץ פוספט (pH 7.0) ומסנן (cutoff: 0.2 μm).</li>
		<li>הוסף את הצמידות של DNA-פפטיד ציסטאין (2 eq., ראה טבלת חומרים) ל- PEG ולהגיב בטמפרטורת החדר במשך >4 שעות. אם עוזבים לילה, לדגור ב 4 °C (75 °F).</li>
		<li>הסר את החומרים הלא מצומדים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם עמודת מטריצה מרוכבת דקסטרן-אגרוז הזמינה מסחרית על כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר (FPLC) (ראה טבלת חומרים). הפעל דגימות ב- PBS ונטר ספיגה ב- 260 ננומטר עבור DNA ו- 280 ננומטר עבור פפטידים.</li>
		<li>רכז את הננו-חיישנים המסונתזים עם צינורות מסנן צנטריפוגליים (MWCO = 10 kDa) בהתאם למהירות המומלצת של היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>כמת את ריכוז הדנ"א באמצעות ערכת בדיקת ssDNA (ראה טבלת חומרים) וקורא לוחות ב- λex: 485 nm ו- λem: 535 nm. אחסן את הננו-חיישנים בטמפרטורה של 4°C.</li>
	</ol></li>
	<li>לאפיין ננו-חיישנים מבוססי פעילות מקודדי DNA.<ol><li>מדוד את גודל החלקיקים ההידרודינמיים של ננו-חיישנים המקודדים בדנ"א באמצעות פיזור אור דינמי (DLS). הערה: טווח הגדלים הצפוי של ננו-חיישנים הוא 15-50 ננומטר, עם גודל ממוצע של 20-30 ננומטר. אם רוצים טווח גדלים מוגבל, ניתן להשתמש ב- FPLC (בשלב 2.3) כדי לבודד שברים צרים יותר עם משקלים מולקולריים שונים.</li>
		<li>רכז את הננו-חיישנים ל -0.5 מ"ג / מ"ל (לפי ריכוז DNA) עם צינורות מסנן צנטריפוגליים (MWCO = 10 kDa) וטען את הדגימות על רשת נחושת מצופה סרט פחמן המורכבת על מחזיק קריו. התבונן במורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (200 kV, הגדלה של 10,000-60,000)14.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הזרקת חיישנים ואיסוף שתן
<ol><li>יש לאסוף שתן למדידה בסיסית.<ol><li>הכניסו את העכבר לתא דיור מותאם אישית (ראו איור משלים 1) עם צלחת בת 96 בארות כבסיס.</li>
		<li>רסן את העכבר והפעל לחץ עדין על שלפוחית השתן כדי לרוקן את שאריות השתן על הצלחת.</li>
		<li>פיפטה את השתן שנאסף (~ 100-200 μL) מן צלחת 96 באר לתוך צינור 1.5 מ"ל לאחר החלפת העכבר לבית רגיל.</li>
	</ol></li>
	<li>הקמת מודל גידול מורין פרה-קליני.<ol><li>חסן עכברות BALB/c בנות 6 עד 8 שבועות על ידי הזרקה תוך ורידית עם קו תאי MC26-Fluc המבטא לוציפראז (100k תאים / עכבר) (ראה טבלת חומרים). מעקב אחר התקדמות הגידול מדי שבוע באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית in vivo . הערה: עומס הגידול הנראה לעין המצוין על ידי אות זוהר מתרחש בערך בשבוע השני של הזרקת קו תאים מסוים זה. בדוק היטב בעלי חיים נושאי גידול במהלך התקדמות הגידול על בסיס קבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>הזרקת ננו-חיישנים בנקודות זמן שונות לאחר השתלת הגידול.<ol><li>הכינו תמיסת הזרקה (נפח מרבי של 200 μL) המכילה ננו-חיישנים בריכוז של 1 nmol על ידי ברקוד DNA ב-PBS סטרילי.</li>
		<li>הזריקו תמיסת חיישן 200 μL ב-PBS לכל עכבר ניסיוני תוך ורידי.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לאסוף דגימות שתן מעכברי בקרה בריאה ועכברים נושאי גידול בשעה אחת לאחר הזרקת החיישן, כמתואר בשלבים 1.1-1.3. הערה: ניתן לעבד דגימות שתן טריות לניתוח ברקוד DNA ישירות או להקפיא מיד על קרח.</li>
</ol>4. זיהוי CRISPR של ברקודי DNA: מבוסס פלואורסצנטיות
<ol><li>השתמשו בדגימות שתן טריות או הפשירו דגימות קפואות על קרח. דגימות שתן צנטריפוגות ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שלב את הריאגנטים בטבלה משלימה 2, הוסף את האנזים Cas12a (ראה טבלת חומרים) אחרון וערבב בעדינות את התגובה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה. לדגור את התגובה ב 37 ° C במשך 30 דקות.</li>
	<li>הפעל את תגובת המדווח, כפי שמוצג בטבלה משלימה 3, במשולש באמצעות המכפלה של שלב 2. הוסף את התגובה משלב 2 האחרון והבא במהירות לקורא הלוחות.</li>
	<li>זהה הפעלת LbaCas12a על ידי מדידת פלואורסצנטיות עם קורא לוחות ב 37 ° C כל 2 דקות במשך 3 שעות (λex: 485 ננומטר ו λem: 535 ננומטר) כדי לפקח על קינטיקה מחשוף של כתב DNA.</li>
	<li>כדי לנתח את נתוני המדידה הפלואורסצנטיים, השתמש בחבילת Python לניתוח קינטיקה של אנזימים הזמין ב- https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. סקריפט זה מחשב את מהירות התגובה הראשונית (V0) באמצעות שיפוע ההתאמה הליניארית של 8-10 נקודות הזמן ההתחלתיות הראשונות.</li>
</ol>5. זיהוי CRISPR של ברקודי DNA: מבוסס נייר
<ol><li>דגימות שתן צנטריפוגות ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: הפעל את דגימות השתן לזיהוי CRISPR מבוסס פלואורסצנטיות ומבוסס נייר במקביל.</li>
	<li>שלב את הריאגנטים בטבלה משלימה 2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. הערה: שלב דגירה זה זהה לזה של זיהוי CRISPR מבוסס פלואורסצנטיות.</li>
	<li>הפעל את תגובת הכתב באמצעות כתב FAM-ביוטין המסומן ב- DNA לבדיקת זרימה צידית על רצועת נייר (ראה טבלת חומרים). שלב את הריאגנטים בטבלה משלימה 4 בצלחת של 96 בארות באמצעות המכפלה של שלב 2. מכסים ברדיד אלומיניום ודגרים ב-37°C למשך שעה. הערה: בחר את זמן הדגירה האופטימלי בהתאם לניטור קינטיקה בזמן אמת בבדיקת זיהוי CRISPR מבוססת פלואורסצנטיות שתוארה לעיל.</li>
	<li>לבאר טרייה של צלחת 96 בארות, להוסיף 80 μL של PBS. הוסף 20 μL של מדגם משלב 3 לבאר זו.</li>
	<li>מניחים פס נייר זרימה רוחבי אחד לכל באר וממתינים עד שהנוזל מגיע לחלק העליון של הרצועה (<5 דקות). חפש את המראה של רצועות הבקרה ו/או הדגימה ברצועת הנייר.</li>
	<li>צלם תמונה של רצועת הזרימה הצידית וכמת את עוצמת הרצועה באמצעות ImageJ.</li>
</ol>

בדיקת סמן ביולוגי סינתטי בשתן CRISPR-Cas לאבחון סרטן

<ol>
	<li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring.">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li><li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities.">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li><li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology.">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li><li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care.">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+new+dimensions.">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biomarkers:+a+twenty-first+century+path+to+early+cancer+detection.">Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection.</a> Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).</li><li>Kirkpatrick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+detection+of+lung+cancer+in+mice+via+noninvasive+pulmonary+protease+profiling.">Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling.</a> Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).</li><li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers.">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease.">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+quantum+dots.">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics.">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics.">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li><li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing.">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216 (2021).</li><li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice.">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li></ol>

S.N.B., L.H. ו-R.T.Z. רשומים כממציאים בבקשת פטנט הקשורה לתוכן עבודה זו. S.N.B. מחזיקה במניות Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, והיא דירקטורית ב-Vertex; מייעץ למודרנה, ומקבל מימון מחקר ממומן מג'ונסון אנד ג'ונסון, רוויטופ וינשוף.

כאן מוצגת פלטפורמה הניתנת להתאמה אישית רבה לגילוי סרטן מרובה משתתפים עם בדיקת שתן ניידת המעריכה פעילות פרוטאוליטית הקשורה למחלה באמצעות חיישן מוזרק זעיר פולשני. כאשר מופעל על ידי פרוטאזות גידוליות, מחשוף המצע הפפטידי מוגבר באמצעות שחרור ברקוד DNA לתוך השתן. את כתבי הדנ"א הסינתטי בדגי?...

למרות המאמץ המשמעותי לזהות סמנים ביולוגיים של גידולים כגון חלבונים שנשפכו ודנ"א, תחום אבחון הסרטן היה מתוח על ידי השפע הנמוך שלהם או השפלה מהירה במחזור הדם1. כאסטרטגיה משלימה, סמנים ביולוגיים סינתטיים מהונדסים ביולוגית המגיבים באופן סלקטיבי לתכונות מחלה כדי ליצור אותות מוגברים מייצגים דרכים חדשות לקראת אבחון מדויק ונגיש 2,3. כדי לסייע בזיהוי, סמנים ביולוגיים סינתטיים אלה רותמים מנגנוני הפעלה תלויי גידול, כגון הגברה אנזימטית, כדי לייצר אנליטים עם יחס אות לרעש משופר4. כאן, קבוצה של אנזימים הקשורים לסרטן, פרוטאזות, ממונפים כדי להפעיל חיישנים ננומטריים הניתנים להזרקה כדי לשחרר מדווחי מחלות הניתנים לזיהוי מהנוזלים הביולוגיים כגון דם או שתן 5,6. לאור ההטרוגניות של הגידול, פיתוח פאנל של חיישנים המופעלים על ידי פרוטאז מאפשר בדיקות מולטיאנליטיות המשלבות אירועי מחשוף פרוטאז שונים לכדי "חתימת מחלה" כדי להעריך היארעות סרטן והתקדמות באופן ספציפי יותר, מרובה.
פותחו סמנים ביולוגיים סינתטיים המופעלים על ידי פרוטאז המהווים מצעי פפטיד מצומדים לפני השטח של נשא אינרטי7. כאשר הם מוזרקים in vivo, פפטידים אלה נישאים אל הגידול, שם מחשוף אנזימטי על ידי פרוטאזות הגידול משחרר את הכתבים לדם או לשתן לצורך זיהוי. זיהוי מרובב עם סמנים ביולוגיים סינתטיים המופעלים על ידי פרוטאז דורש שכל סמן ביולוגי סינתטי בתוך קוקטייל יסומן בברקוד מולקולרי ייחודי. לשם כך פותחו גישות שונות, כולל ברקודים המוניים וכתבים מקודדי ליגנד 8,9,10. בניגוד לשיטות אלה של ריבוב אשר עשויות להיות מוגבלות למספר אפשרויות אות שונות, ברקוד DNA מאפשר שילובים רבים יותר בהתאם למורכבות הגבוהה וההטרוגניות של מצבי מחלה אנושיים. כדי להרחיב את הריבוי של סמנים ביולוגיים סינתטיים, החיישנים מקודדים על ידי תיוג כל כתב עם רצף DNA ייחודי לזיהוי באמצעות נוקלאז CRISPR-Cas כדי להגביר את האות הביופלואיד ex vivo. ברקודים אלה של דנ"א חד-גדילי (ssDNA) מתוכננים להיקשר לרנ"א מנחה קריספר משלים (crRNAs), ולהפעיל את פעילות הנוקלאז הבטחוני המופעל על ידי המטרה של CRISPR-Cas12a11. ניתן להשתמש בפעילות נוקלאז זו כדי לבקע גדיל דנ"א של כתב שזוהה באמצעות קינטיקה פלואורסצנטית או באמצעות רצועות נייר.
בנוסף להגברה מולקולרית באמצעות פרוטאזות (in vivo) ו-CRISPR-Cas (ex vivo), מאפיין מרכזי נוסף של סמנים ביולוגיים סינתטיים המופעלים על ידי פרוטאז כרוך ברתימת פרמקוקינטיקה ננו-חומרית להגדלת ריכוז אות האבחון בנוזלים ביולוגיים10. גישה אחת היא שימוש בנשא ננו-חלקיקים כדי להגדיל את זמן הסירקולציה של מצעי פפטיד מצומדים על פני השטח. דנדרימר פוליאתילן גליקול (PEG) נבחר כננו-נשא בעל קוטר הידרודינמי קטן יחסית ורב-ערכיות כדי להגביר את המסירה לגידולים. בעוד שהוא קטן מספיק כדי לקדם את העברת הגידול, גודלו של נשא ה- PEG גדול יותר מהחתך בגודל ~ 5 ננומטר של מחסום הסינון הגלומרולרי של הכליה, כך שרק מצעי פפטיד שסועים יכולים להתנקות לתוך השתן, תוך ניצול סינון הגודל על ידי הכליות12. בפרוטוקול זה, תהליך העבודה הרב-שלבי מתואר לסינתזה וליישום של ננו-חיישנים מבוססי פעילות ברקוד-DNA במודל מורין פרה-קליני, תוך הדגשת ההתקנה של בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, אשר שימשה קבוצה זו כדי לסווג את מצב המחלה במודלים מורינים של סוגי סרטן מרובים13. הודות לעקרון התכנון הרב-תכליתי, כל שלושת המרכיבים הפונקציונליים של הננו-חיישן - הננו-נשא (פולימר PEG), המודול המגיב לגירויים (מצע המופעל על ידי פרוטאז) והכתב הביופלואיד (ברקוד DNA) - ניתנים להחלפה מדויקת בהתאם לצרכים ספציפיים ליישום, מה שמאפשר מודולריות על ידי התאמת ספציפיות המטרה והשחרור.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x NEB Buffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6002SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3&#8217;-DBCO group</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column</td>
			<td>&#160;Agilent</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td></td>
			<td>Various volumes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic transmission electron microscopy</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>cyroTEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine terminated DNA-peptide conjugates</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &#181;M</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental animals</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td>BALB/cAnNTac</td>
			<td>6&#8211;8&#8201;weeks of age</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>MGHD 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization&#8211;time of flight (MALDI&#8211;TOF) mass spectrometry&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex MALDI&#8211;TOF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC26-Fluc cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python, Version 3.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.python.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O11492</td>
			<td>ssDNA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA FAM-T10-Quencher and&#160; FAM-T10-Biotin reporter substrates</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td>For FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite Pro M200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas-mediated multianalyte synthetic urine biomarker test for portable diagnostics

יצירת סמנים ביולוגיים סינתטיים לפיתוח אבחון מדויק אפשרה זיהוי מחלות דרך מסלולים מעבר לאלה המשמשים למדידות ביו-נוזליות מסורתיות. סמנים ביולוגיים סינתטיים בדרך כלל עושים שימוש בכתבים המספקים אותות קריאים בנוזל הביולוגי כדי לשקף את השינויים הביוכימיים במיקרו-סביבה המקומית של המחלה במהלך היארעות המחלה והתקדמותה. הריכוז הפרמקוקינטי של המדווחים וההגברה הביוכימית של אות המחלה הם בעלי חשיבות עליונה להשגת רגישות גבוהה וספציפיות בבדיקת אבחון. כאן, פלטפורמה לאבחון סרטן בנויה באמצעות פורמט אחד של סמנים ביולוגיים סינתטיים: ננו-חיישנים מבוססי פעילות הנושאים כתבי DNA מיוצבים כימית שניתן לשחרר על ידי חתימות פרוטאוליטיות חריגות במיקרו-סביבה של הגידול. דנ"א סינתטי כמדווח מחלות מעניק יכולת ריבוב באמצעות השימוש בו כברקוד, המאפשר קריאה של חתימות פרוטאוליטיות מרובות בבת אחת. כתבי דנ"א המשוחררים לשתן מזוהים באמצעות נוקלאזות CRISPR באמצעות הכלאה עם RNA קריספר, אשר בתורו מייצרים אות פלואורסצנטי או קולורימטרי בעת הפעלת האנזים. בפרוטוקול זה נבנים ננו-חיישנים מבוססי פעילות המבוססים על ברקוד DNA ויישומם מודגם במודל עכברי פרה-קליני של סרטן מעי גס גרורתי. מערכת זו ניתנת לשינוי רב על פי הביולוגיה של המחלה ומייצרת אותות מחלה מרובים בו זמנית, מה שמאפשר הבנה מקיפה של מאפייני המחלה בתהליך זעיר פולשני הדורש מתן ננו-חיישנים בלבד, איסוף שתן ובדיקת נייר המאפשרת אבחון נקודתי.

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

מחבר זרקור: כלים מולקולריים הנדסיים לזיהוי מחלות והדמיה

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

מינוי מצעי פפטיד המופעלים על ידי פרוטאז כדי לתכנן חיישנים שישקפו שינויים בפעילות הפרוטאוליטית של הרקמה, פעילות הפרוטאז ברקמה מאופיינת תחילה באמצעות ספרייה של גשושיות פפטידיות13 (איור 1). דגימות רקמה טריות וקפואות יכולות לספק מידע משמעותי על הפעילות...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

מעבדת הלב מהנדסת כלים מולקולריים ותאיים כדי לעקוב במדויק אחר ביולוגיה של מחלות ולשלוט בהן. אנו משתמשים במידע מיוחד על רקמות חולות כדי ליידע את התכנון של כלי זיהוי, הדמיה וטיפול מגיבים להפרעות הטרוגניות. נוזלים ביולוגיים מהווים הזדמנות נוחה לזיהוי מחלות והערכה, אך אלה מוגבלים לעתים קרובות על ידי כמויות נמוכות של אנליטים רלוונטיים.כתוצאה מכך, רוב התחום רודף אחר אסטרטגיות להגברת אותות הקשורים למחלות כדי לשפר את הרגישות של בדיקות אבחון, כמו BCR ופלזמה פני השטח בתהודה. במקום להסתמך על סמנים ביולוגיים של מחלות אנדוגניות במחזור, הגישה שלנו משתמשת בסמנים ביולוגיים סינתטיים כדי לדווח על פעילות המחלה כאשר היא משוחררת מננו-חיישנים מוזרקים. הסמנים הביולוגיים הסינתטיים שלנו הם ברקודי DNA מיוצבים כימית, המאפשרים לזהות אותות מיקרו-סביבה של מחלות מרובות בבת אחת, ולזהות אותם באמצעות הברקוד המתאים.

crispr-cas-mediated-multianalyte-synthetic-urine-biomarker-test-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

637 Views.  Boston University. מעבדת הלב מהנדסת כלים מולקולריים ותאיים כדי לעקוב במדויק אחר ביולוגיה של מחלות ולשלוט בהן. אנו משתמשים במידע מיוחד על רקמות חולות כדי ליידע את התכנון של כלי זיהוי, הדמיה וטיפול מגיבים להפרעות הטרוגניות. נוזלים ביולוגיים מהווים הזדמנות נוחה לזיהוי מחלות והערכה, אך אלה מוגב?...

Video: מחבר זרקור: כלים מולקולריים הנדסיים לזיהוי מחלות והדמיה

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

Nanosensor Characterization and CRISPR-Cas Mediated Urine Biomarker Test for Cancer Diagnostics

To begin, dissolve two milligrams of multivalent PEG with maleimide reactive group, and one milliliter of 100 millimolar phosphate buffer. Filter the solution through a 0.2 micrometer filter. Add the cysteine terminated DNA peptide conjugates to the solution.Use size exclusion chromatography to remove the unconjugated materials. Run the samples in PBS. Monitor the absorbance of the to detect DNA and peptides.Place the sample in the centrifugal filter tubes and concentrate the synthesized nanosensors by centrifugation according to the manufacturer's recommended speed. Use a 96-well plate as the base for a customized housing chamber. To collect the urine for baseline measurements, first place a mouse in the housing chamber.Apply gentle pressure on the restrained mouse's bladder to expel any remaining urine onto the plate. Pipette the collected urine into a 1.5 milliliter tube. Prepare 200 microliters of the nanosensor injection solution in sterile PBS.Intravenously inject 200 microliters of the solution into each mouse. After one hour of injection, collect the urine samples from the control and experimental mice. For fluorescence-based CRISPR detection of the DNA barcodes, centrifuge the urine samples at 800 G for five minutes at room temperature.Now combine the CRISPR reagents, then add the Cas12a enzyme before gently pipetting the reaction mixture up and down. Incubate the reaction mixture at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Then run the reporter reaction using the FRET-based reporter DNA mixture.Add the mixture to a 384-well plate and immediately measure the fluorescence at 37 degrees Celsius every two minutes for three hours to monitor the cleavage kinetics. To perform paper-based CRISPR detection, run an alternative reporter reaction following the incubation of the CRISPR reaction using a FAM-Biotin labeled DNA reporter. After combining the reagents into a 96-well plate, cover it with aluminum foil, then place the plate in an incubator at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Now add 80 microliters of PBS into a fresh well of a 96-well plate. Pipette 20 microliters of reporter reaction mixture into this well. Place a lateral flow paper strip to each well, and wait until the liquid reaches the top of the strip.The chemically modified single-stranded DNA demonstrated Cas12a activation relative to the unmodified double stranded DNA and single stranded DNA. Modified DNA molecules in unprocessed urine showed colorimetric readout on lateral flow paper strips. The leading sample band indicated the release of detectable FAM through reporter cleavage triggered by urinary DNA.