תגובות ביטוי נטולות תאים בתפזורת עם שלפוחיות יונילמלריות קטנות (SUV) עבור יישומי תאים סינתטיים

כדי להתחיל, נשפו זרם עדין של ארגון לתוך בקבוקון זכוכית המכיל שומנים POPC תוך סיבוב עדין של הבקבוקון. כאשר השומנים התייבשו כסרט בתחתית הבקבוקון, מכסים אותו באופן רופף, ואז מעבירים אותו לייבוש. לאחר שעה להוסיף 0.5 מיליליטר של מים טהורים ultrapure deionized כדי להמיס את הסרט השומנים.

מערבלים את הפתרון במשך שתי דקות. לאחר מכן, השרו שני תומכי מסנן ומים נטולי יונים. הניחו אותם על כל אחד מתומכי הממברנה הפנימיים.

לאחר מכן הניחו מסנן פוליקרבונט בגודל 100 ננומטר בין שני תומכי הממברנה הפנימיים, המוחזקים יחד על ידי המעטפת החיצונית של המכבש ואום התומך. הנח את ההתקנה במעמד האקסטרודר כדי לסיים את הגדרת מנגנון האקסטרוזיה המיני. לאחר מכן, לטעון את תערובת מי שומנים לתוך מזרק אחד מיליליטר gast הדוק.

השתמש בתפסי זרוע נדנדה כדי לאבטח את המזרק לקצה אחד של המכבש הקטן. הכנס את המזרק השני לקצה השני של המיני אקסטרודר, וודא שהוא מדוכא לחלוטין. עכשיו להעביר את תערובת מי השומנים מן המזרק המקורי לתוך אחד ריק דרך המנגנון.

לאחר חזרה על האקסטרוזיה 11 פעמים, מעבירים את רכבי השטח לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי להרכיב את פרוטוקול הביטוי ללא תאים, פיפטה תמיסות פלזמיד DNA אחד עד 3 קידוד עבור SFGFP מסיס או גרסאות של קולטן גלוטמט SFGFP, RNAse מורין ותמיסת SUV לתוך בקבוקון. הוסף מים טהורים במיוחד deionized כדי להביא את נפח התגובה ל 20 מיקרוליטר.

העבר את פתרון הביטוי ללא תאים ללוח תחתון V חרוטי היטב 96. דוגרים על הצלחת בקורא צלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד חמש שעות. הגדר את קורא הלוחות עם רווח של 100, עירור של 485 ננומטר, פליטה של 528 ננומטר, זמן ריצה של חמש שעות, ומדידת מרווח של קריאה אחת לכל שתי דקות.

מדוד את אות ה- GFP כל שתי דקות כדי לנטר את התגובה ללא תאים בזמן אמת. SFGFP מסיס היה בעל הביטוי הגבוה ביותר מבין כל שלושת החלבונים.