APL מודה בתמיכת הקרן הלאומית למדע (EF1935265), המכונים הלאומיים לבריאות (R01-EB030031 ו-R21-AR080363) ומשרד המחקר הצבאי (80523-BB)

הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר זה מוצגים בטבלת החומרים.
1. תגובות CFE בתפזורת בנוכחות שלפוחיות חד-למלריות קטנות (SUV)
<ol><li>הכנת רכב שטח הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם להוראות הבטיחות לעבודה עם כלורופורם.<ol><li>הכינו רכבי שטח 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) בבקבוקון זכוכית על ידי העברת 76 μL של 25 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי POPC מומסת בכלורופורם.</li>
		<li>תוך כדי סיבוב עדין של בקבוקון הזכוכית, נשפו זרם עדין של ארגון לתוך הבקבוקון כדי ליצור סרט של שומנים מיובשים בתחתית. לאחר מכן, העבירו את בקבוקון הזכוכית למייבש כשהפקק מוברג באופן רופף כדי לאדות עודפי כלורופורם.</li>
		<li>שמור את בקבוקון הזכוכית במייבש למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף 0.5 מ"ל מים טהורים במיוחד deionized כדי להמיס את הסרט שומנים מערבולת במשך כ 2 דקות.</li>
		<li>הגדירו מנגנון מיני אקסטרוזיה על ידי השריית שני תומכי מסנן במים נטולי יונים, והצבתם על כל אחד מתומכי הממברנה הפנימיים. לאחר מכן, השרו מסנן פוליקרבונט 100 ננומטר והניחו אותו בין שני תומכי הממברנה הפנימיים המוחזקים יחד על ידי המעטפת החיצונית של המכבש ואום התומך. מקם הגדרה זו במעמד המכבש.</li>
		<li>יש לשטוף שני מזרקים אטומים לגזים בנפח 1 מ"ל 3 פעמים במים טהורים במיוחד שעברו דה-יוניזציה.</li>
		<li>טען את הדגימה של תערובת שומנים-מים לאחד המזרקים האטומים לגז בנפח 1 מ"ל והנח אותה בקצה אחד של מכבש המיני באמצעות תפסי זרוע הנדנדה כדי להחזיק את המזרק במקומו. הכנס את המזרק השני לקצה השני של המיני מכבש וודא שהוא מדוכא לחלוטין. הערה: בעת העמסת המזרק בתערובת מי השומנים, ודא שאין אוויר במזרק לפני העברתו דרך המכבש הקטן.</li>
		<li>מעבירים בעדינות את תערובת מי השומנים מהמזרק המקורי למזרק הריק דרך מכשיר המיני-אקסטרודר. חזור על שלב זה 11 פעמים כדי ליצור רכבי שטח. מעבירים את רכבי השטח לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את תמיסת SUV בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.</li>
	</ol></li>
	<li>מכלול תגובת CFE<ol><li>הרכיב את תגובת CFE על-ידי ביצוע פרוטוקול הביטוי ללא תאים שסופק על-ידי היצרן עם שינויים קלים המפורטים להלן.</li>
		<li>ערבוב 10 μL של תמיסה 1 (המכילה חומצות אמינו, NTPs, tRNA ומצעים לאנזימים, וחיץ הכרחי), 1 μL של תמיסה 2 (חלבונים ב-20% גליצרול), 2 μL של תמיסה 3 (ריבוזום (20 μM)), כמות מתאימה של קידוד DNA עבור sfGFP-sfCherry מסיס (1-10)27 (להלן sfGFP מסיס), WT-GluR0-sfGFP או PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ננוגרם/1000 זוגות בסיסים), 1 μL מעכב RNAse murine, ו 4 μL של 5 mM תמיסת SUV עבור חלבוני ממברנה או 4 μL מים עבור חלבונים מסיסים.</li>
		<li>הביאו את הנפח הסופי של התגובה ל-20 מיקרוליטר על ידי הוספת מים טהורים במיוחד שעברו דה-יוניזציה. הערה: בעת הרכבת מערכת CFE, כל הרכיבים חייבים להישמר על קרח. כל החומרים רגישים לטמפרטורה ועלולים להתפרק אם הם מגיעים לטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>דגירה וניטור של תגובת CFE<ol><li>העבירו את תמיסת CFE ללוח V תחתון חרוטי בעל 96 בארות. כדי למנוע אידוי במהלך התגובה, מכסים את הצלחת באמצעות סרט איטום.</li>
		<li>דגור על הצלחת ב-37°C בקורא לוחות למשך 4-5 שעות תוך ניטור תגובת CFE על ידי מדידת אות GFP עם רווח של 100 באורכי גל עירור/פליטה של 488 ננומטר / 528 ננומטר כל 2 דקות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. תגובות CFE מקופלות ב- GUV
<ol><li>הכנת תמיסת חיץ חיצוני GUV<ol><li>בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מערבבים 1.5 μL של 1 M זרע, 37.5 μL של 100 mM ATP, 25 μL של 100 mM GTP, 12.5 μL של 100 mM CTP, 12.5 μL של 100 mM UTP, 25 μL של 1 M קריאטין פוספט, 18 μL של 1 M מגנזיום אצטט, 93.33 μL של 3M אשלגן גלוטמט, 50 μL של 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL של 332 mM חומצה פולינית, 100 μL של 2 M גלוקוז, ו 50 μL מתמיסת מלאי של 6 mM תערובת של כל אחת מ -20 חומצות אמינו (הוכן על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר על ידי Sun et al.28).</li>
		<li>הביאו את הנפח הסופי של התמיסה ל-1 מ"ל על ידי הוספת מים מטוהרים במיוחד שעברו דה-יוניזציה. הערה: כל הרכיבים חייבים להישמר על קרח. מוסיפים את תערובת חומצות האמינו בסוף כדי למנוע דלדול חומצות אמינו28. הפתרון יכול להיות aliquoted ב 330 μL aliquots ומאוחסן ב -20 ° C עד השימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תערובת שומנים בשמן הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם להוראות הבטיחות לעבודה עם כלורופורם.<ol><li>במכסה אדים, ערבבו 17.3 מיקרוליטר של 25 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי POPC ו-1.08 מיקרוליטר של קופולימר פולי(בוטאדיאן)-בי-פולי(אתילן אוקסיד) (PEO-b-PBD) בבקבוקון זכוכית של 15 מ"ל. הערה: תמיסת השומנים בשמן הסופית מכילה שומנים של 0.5 מילימטר עם 95% ו-5% POPC ו-PEO-b-PBD, בהתאמה. PEO-b-PBD שימש לשיפור יציבות הממברנה במהלך ביטוי חלבונים, אך נשמר ביחס מולארי נמוך כדי להפחית את נטיית הקופולימר להצטבר למיצלות נפרדות ממולקולות שומנים29,30.</li>
		<li>נשפו בזהירות זרם עדין של גז ארגון לתוך בקבוקון הזכוכית תוך כדי סיבוב הבקבוקון כדי לאדות את הכלורופורם.</li>
		<li>פיפטה 1.2 מ"ל של שמן מינרלי קל לתוך בקבוקון זכוכית 15 מ"ל המכיל את השומנים המיובשים.</li>
		<li>מערבבים את השומנים והשמן על ידי ערבול במהירות מקסימלית במשך 10-20 שניות. תערובת השומנים-קופולימרים המומסים תיראה מעונן.</li>
		<li>כדי להבטיח שכל אגרגטי השומנים האפשריים בשמן מומסים במלואם ומפוזרים ברחבי השמן, מכניסים את בקבוקון הזכוכית לתנור בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני מערבלים 10-20 שניות נוספות במהירות מרבית.</li>
	</ol></li>
	<li>הרכבה ואנקפסולציה של תגובת CFE (איור 1 מסכם את השלבים הבאים).<ol><li>הכן 300 μL של התמיסה החיצונית GUV בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על ידי ערבוב 270 μL של תמיסת חיץ חיצונית CFE שהוכנה בשלב 2.1, 15 μL של 5 M NaCl ו- 15 μL של 4.5 M KCl. הערה: בשלב זה, הוסף 0.45 μL של 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) לתמיסת GUV החיצונית. מטרת הוספת NaCl ו-KCl היא להתאים את האוסמוליות של התמיסה החיצונית כך שתתאים אותה לתמיסת CFE הפנימית. הנפח המדויק של NaCl ו- KCl תלוי בהתאמת האוסמוליות הרצויה. אפשר להוסיף NaCl או KCl או שניהם כדי להתאים את האוסמוליות.</li>
		<li>יש לערבב בעדינות פיפטה 300 μL של תערובת שומנים בשמן על גבי התמיסה החיצונית של GUV. הערה: בעת הוספת תערובת שמן השומנים, חשוב שהשמן לא יתערבב עם התמיסה החיצונית המימית. לאחר התוספת, צריך להיות ממשק גלוי בין תערובת השומנים בשמן לבין התמיסה החיצונית של GUV.</li>
		<li>דוגרים על ממשק שמן-מים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר לחד-שכבה השומנית להיווצר ולהתייצב בממשק.</li>
		<li>בינתיים, עקוב אחר סעיף 1.2.1 כדי להרכיב תגובת CFE המכילה את הדנ"א הפלסמיד המקודד את גרסאות חלבון הממברנה או GFP מסיס. החלף את 4 μL של תמיסת SUV 5 mM או מים עם 4 μL של 1 M סוכרוז. תגובה זו תהיה הפתרון הפנימי של GUV. הערה: אוסמומטר שימש למדידת האוסמוליות של התמיסות הפנימיות והחיצוניות. האוסמוליות של התמיסה החיצונית הותאמה בהתאם על ידי תוספת של NaCl או מים. האוסמוליות של תגובת CFE היא בדרך כלל סביב 1600 mOsm/Kg. הוספת סוכרוז לתגובה מגדילה את צפיפות התמיסה הפנימית, ובכך מאפשרת לשלפוחיות לנוע על פני ממשק שמן-מים במהלך שלב הצנטריפוגה. חלופה לסוכרוז היא פתרון שיפוע צפיפות Opti-Prep.</li>
		<li>הוסף 600 μL של תערובת שמן שומנים לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל את תגובת CFE ופיפטה למעלה ולמטה במרץ במשך ~ 1 דקות כדי לתחליב את התגובה בתמיסת שומנים בשמן וליצור את חד-שכבת השומנים סביב תאים סינתטיים. הערה: הפתרון הסופי לא צריך להיות בועות צריך להיראות אטום.</li>
		<li>מחזירים בעדינות את תחליב התמיסה הפנימי על גבי שכבת השמן בצינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שבו הוקם ממשק שמן-מים. הערה: היזהר שלא להפריע או לערער את יציבות הממשק.</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,000 x גרם ב-4°C. הערה: מהירות הצנטריפוגה הותאמה לפרוטוקול זה. Adir et al.31 דיווחו על מהירות צנטריפוגה שונה.</li>
		<li>לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את עודפי הנפט והתמיסה החיצונית מצינור המיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטטור. הסר את התמיסה החיצונית עד שהנפח הנותר הוא סביב 100 μL. הערה: גלולה של GUV נראית בדרך כלל בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה. עם זאת, היעדר גלולה נראית לעין לא בהכרח אומר שאין תשואה של GUV. במקום להשתמש בפיפטטור, ניתן להסיר את עודפי השמן על גבי התמיסה החיצונית על ידי שאיפה. חשוב לוודא שתמיסת השומנים בשמן מוסרת לחלוטין. זיהום שמן בתמיסת GUV עלול לגרום לתמונות באיכות נמוכה.</li>
		<li>השהה מחדש את גלולת ה- GUV בתמיסת 100 μL הנותרת על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. לאחר מכן, העבר את פתרון ה- GUV לצלחת תחתונה שטוחה נקייה 96 שקופה היטב כדי לדגור.</li>
	</ol></li>
</ol>3. אינקובציה והדמיה של תגובת CFE בכמוסה
<ol><li>כסו את הצלחת באמצעות סרט איטום למניעת אידוי. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 5-6 שעות. ניתן להשתמש בקורא צלחות ולבצע את שלב 1.3.2 כדי להכין את קורא הצלחות לשלב הדגירה.</li>
	<li>לאחר סיום הדגירה, הניחו את לוח הבאר 96 על שלב ההדמיה של מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת EMCCD (או מצלמת sCMOS), לייזר נשלט DAQ-MX (או מערכת משולבת משולב לייזר), ודיסק מסתובב CSU-X1 קונפוקלי (או קונפוקלי סריקת לייזר). התמקד בכל החזר השקעה המכיל GUV וצלם תמונות באורך גל עירור של 488 ננומטר באמצעות יעד Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.</li>
	<li>שמור תמונות של GUV בתבנית .tiff.</li>
	<li>פתח את התמונות בתוכנת עיבוד תמונה (לדוגמה, ImageJ או פיג'י). פתחו את חלונית ההגדרות 'בהירות/ניגודיות '. התאם את הבהירות והניגודיות להגדרות מתאימות שהופכות חלבונים פלואורסצנטיים לגלויים.</li>
	<li>אם המטרה היא להשוות את עוצמת האות של חלבונים שונים המבוטאים, ערמו תחילה תמונות בודדות של GUV המכילות חלבונים שונים באמצעות החלונית Images to Stack הממוקמת בתפריט המשנה Image > Stacks . לאחר מכן, התאימו את הבהירות והניגודיות של כל התמונות באמצעות החלונית 'בהירות/ניגודיות '.</li>
</ol>

ביטוי תאי של חלבוני ממברנה בשלפוחיות חד-לאומיות ענקיות

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue-scale+properties+with+synthetic+cells:+Forging+one+from+many.">Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many.</a> ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).</li><li>Powers, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomimetic+functions+of+synthetic+cells+through+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis.">Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis.</a> Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Past,+present+and+future.">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li><li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells.">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).</li><li>Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cell+as+a+platform+for+understanding+membrane-membrane+interactions.">Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions.</a> Membranes. 11 (12), 912 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture.">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes.">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236 (2021).</li><li>Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+photosynthetic+cell+producing+energy+for+protein+synthesis.">Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).</li><li>Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+and+bidirectional+communication+in+synthetic+cell+communities.">Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities.</a> ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-based+juxtacrine+signaling+between+synthetic+cells.">Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+performance+of+a+cell-free+biosensor+encapsulated+in+lipid+vesicles.">Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles.</a> Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Protein+expression+in+cell-free+systems.">Membrane Protein expression in cell-free systems.</a> Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).</li><li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li><li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis.">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li><li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems:+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes.">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li><li>Dondapati, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+membrane+proteins+derived+from+eukaryotic+cell-free+systems.">Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems.</a> Front Pharmacol. 10, 917 (2019).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+and+reconstitution+using+mammalian+cell-free+lysates+enables+the+systematic+study+of+the+regulation+of+LINC+complex+assembly.">In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly.</a> Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+liposome-assisted+synthesis+of+membrane+proteins+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.</a> Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).</li><li>Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins.">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li><li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis.">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429 (2021).</li><li>Steink&#252;her, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation.">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor.">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hsu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+DNA-mediated+membrane+fusion+in+synthetic+cells.">Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells.</a> Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+membrane-membrane+interfaces+by+interspy.">Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy.</a> Small. 19 (13), 2202104 (2023).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

כמעט כל תהליך תאי שתלוי בהעברת מולקולות או מידע על פני קרום התא, כמו איתות תאי או עירור תאים, דורש חלבוני ממברנה. לפיכך, ההרכבה מחדש של חלבוני הממברנה הפכה לצוואר הבקבוק העיקרי במימוש עיצובים שונים של תאים סינתטיים עבור יישומים שונים. בנייה מחדש מסורתית בתיווך דטרגנטים של חלבוני ממברנה בקר...

ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה זכתה להתעניינות גוברת בעשור האחרון כתחום מתפתח עם יישומים פוטנציאליים רבים בביו-הנדסה, אספקת תרופות ורפואה רגנרטיבית 1,2. התפתחותם של תאים סינתטיים כאבן פינה של ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה, במיוחד, משכה מגוון רחב של קהילות מדעיות בשל היישומים המבטיחים של תאים סינתטיים, כמו גם תכונותיהם הפיסיקליות והביוכימיות דמויות התא המאפשרות מחקרים ביופיזיקליים במבחנה 3,4,5,6 . תאים סינתטיים מהונדסים לעתים קרובות בשלפוחיות חד-למלריות ענקיות בגודל תא (GUVs) שבהן נוצרים מחדש תהליכים ביולוגיים שונים. בנייה מחדש של שלד התא 7,8, התחדשות אנרגיה תלוית אור9, תקשורת תאית10,11 וחישה ביולוגית12 הן דוגמאות למאמצים שנעשו לשחזר התנהגויות דמויות תאים בתאים סינתטיים.
בעוד שתהליכים תאיים מסוימים מסתמכים על חלבונים מסיסים, מאפיינים רבים של תאים טבעיים, כגון חישה ותקשורת, משתמשים לעתים קרובות בחלבוני ממברנה, כולל תעלות יונים, קולטנים ומובילים. אתגר מרכזי בהתפתחות תאים סינתטיים הוא בנייה מחדש של חלבוני ממברנה. למרות ששיטות מסורתיות של בנייה מחדש של חלבון ממברנה בשכבות שומנים מסתמכות על טיהור בתיווך חומרי ניקוי, שיטות כאלה מייגעות, אינן יעילות עבור חלבונים רעילים לביטוי מארח, או לעתים קרובות אינן מתאימות להרכבה מחדש של חלבון הממברנה ב- GUVs13.
שיטה חלופית לביטוי חלבונים היא מערכות ביטוי ללא תאים (CFE). מערכות CFE היו כלי רב עוצמה בביולוגיה סינתטית המאפשר ביטוי חוץ גופי של חלבונים שונים באמצעות ליזט התא או מכונות תרגום שעתוק מטוהרות14. מערכות CFE יכולות להיות עטופות גם ב- GUVs, ובכך לאפשר תגובות סינתזת חלבונים ממודרות שניתן לתכנת ליישומים שונים, כגון יצירת תאים סינתטיים קצירת אור9 או ביוסנסורים רגישים למכנו15,16. בדומה לשיטות ביטוי חלבון רקומביננטי, ביטוי חלבון ממברנה מאתגר במערכות CFE17. צבירה, קיפול שגוי וחוסר שינוי לאחר תרגום במערכות CFE הם צווארי בקבוק עיקריים המעכבים סינתזת חלבון ממברנה מוצלחת באמצעות מערכות CFE. הקושי בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה מלמטה למעלה באמצעות מערכות CFE נובע בחלקו מהיעדרו של מסלול ביוגנזה מורכב של חלבון ממברנה המסתמך על פפטידים של אותות, חלקיקי זיהוי אותות, טרנסלוקונים ומולקולות מלוות. עם זאת, לאחרונה, מחקרים רבים הציעו כי נוכחות של מבנים קרומיים כגון מיקרוזומים או ליפוזומים במהלך התרגום מקדמת ביטוי מוצלח של חלבון הממברנה 18,19,20,21. בנוסף, Eaglesfield et al. ו- Steinküher et al. מצאו כי הכללת תחומים הידרופוביים ספציפיים המכונים פפטידים אותות ב- N-terminus של חלבון הממברנה יכולה לשפר באופן משמעותי את ביטויו22,23. בסך הכל, מחקרים אלה מציעים כי ניתן להתגבר על האתגר של בנייה מחדש של חלבון הממברנה בתאים סינתטיים אם תרגום החלבון מתרחש בנוכחות קרום GUV ואם נעשה שימוש בפפטיד אות N-טרמינלי תקין.
כאן, מוצג פרוטוקול לאנקפסולציה של סינתזת חלבונים באמצעות אלמנטים רקומביננטיים (PURE) תגובות CFE לבנייה מחדש של חלבון ממברנה ב- GUVs. קולטן גלוטמט חיידקי24 (GluR0) נבחר כחלבון קרום המודל, ונבדקת ההשפעה של פפטיד האות N-terminal שלו על המבנה מחדש של הממברנה שלו. ההשפעה של פפטיד אות פרוטאורודוסין, שהוכח כמשפר את יעילות הבנייה מחדש של חלבון הממברנה על ידי Eaglesfield et al.22, נחקרת על ידי בניית גרסה מוטנטית של GluR0 המסומנת כ- PRSP-GluR0 וביטויו ולוקליזציה של הממברנה עם GluR0 מסוג פראי (המכונה WT-GluR0 להלן) המכיל את פפטיד האות המקורי שלו. פרוטוקול זה מבוסס על שיטת תחליב הפוך25 עם שינויים שהופכים אותו לחזק עבור אנקפסולציה CFE. בשיטה המוצגת, תגובות CFE מתחלבות תחילה באמצעות תמיסת שומנים בשמן המייצרת טיפות בגודל מיקרון המכילות את מערכת CFE ומיוצבות על ידי חד-שכבה השומנית. לאחר מכן טיפות האמולסיה מונחות בשכבות על גבי ממשק שמן-מים הרווי בחד-שכבה שומנית נוספת. טיפות האמולסיה נאלצות לנוע על פני ממשק שמן-מים באמצעות כוח צנטריפוגלי. בתהליך זה, הטיפות מקבלות חד-שכבתית נוספת, ובכך יוצרות שלפוחית שומנים דו-שכבתית. לאחר מכן מודגרים ה-GUV המכילים את תגובת CFE, שבמהלכה חלבון הממברנה מבוטא ומשולב בקרום ה-GUV. למרות שפרוטוקול זה מוגדר לביטוי ללא תאים של GluR0, ניתן להשתמש בו לסינתזה ללא תאים של חלבוני ממברנה אחרים או יישומים שונים של תאים סינתטיים כגון בנייה מחדש של שלד ציטו-שלד או מחקרי איחוי ממברנות26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

מערכות ביטוי חופשי של תאים (CFE) הן כלים רבי עוצמה בביולוגיה סינתטית המאפשרים ביומימיקריה של תפקודים תאיים כמו חישה ביולוגית והתחדשות אנרגיה בתאים סינתטיים. שחזור של מגוון רחב של תהליכים תאיים, לעומת זאת, דורש בנייה מחדש מוצלחת של חלבוני ממברנה לתוך הממברנה של תאים סינתטיים. בעוד שהביטוי של חלבונים מסיסים הוא בדרך כלל מוצלח במערכות CFE נפוצות, הבנייה מחדש של חלבוני ממברנה בדו-שכבות שומנים של תאים סינתטיים הוכחה כמאתגרת. כאן, מודגמת שיטה לבנייה מחדש של חלבון קרום מודל, קולטן גלוטמט חיידקי (GluR0), בשלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs) כמודל תאים סינתטיים המבוסס על אנקפסולציה ודגירה של תגובת CFE בתוך תאים סינתטיים. באמצעות פלטפורמה זו, הודגמה ההשפעה של החלפת פפטיד האות N-terminal של GluR0 בפפטיד אות פרוטאורהודופסין על טרנסלוקציה קו-תרגומית מוצלחת של GluR0 לממברנות של GUV היברידי. שיטה זו מספקת הליך חזק שיאפשר בנייה מחדש ללא תאים של חלבוני ממברנה שונים בתאים סינתטיים.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

מחבר זרקור: מבנה מחדש של חלבון ממברנה בתאים סינתטיים

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

לפני האנקפסולציה של תגובות CFE, שתי גרסאות של GluR0-sfGFP המכילות פפטידים של אותות מקוריים ופרוטאורהודופסין (רצפי פפטידי אותות מוצגים בטבלה משלימה 1), וה-sfGFP המסיס בוטאו בנפרד בתגובות בתפזורת, והביטוי שלהן נוטר על-ידי זיהוי אות sfGFP באמצעות קורא לוחות (איור 2A). חלב...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Protein Reconstitution in Synthetic Cells at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את שיטת התחליב ההפוך המשמשת לתמצת מערכת ביטוי ללא תאים (CFE) בתוך שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV) לחקר הסינתזה והשילוב של חלבון קרום מודל בדו-שכבתי השומנים.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

הפרוטוקול שלנו מתייחס להרכבה מחדש של חלבון ממברנה בתוך דו-שכבת השומנים של תא סינתטי שנעשה בשיטת תחליב טיפות הפוך. היתרון בשימוש בשיטת תחליב טיפות הפוך הוא ביכולתה לייצר תאים סינתטיים המספקים סביבה יציבה לביטוי תאי של חלבוני ממברנה. הפרוטוקול שלנו מציע שיטה חזקה לחוקרים בתחום לסנתז חלבוני ממברנה בתוך תאים סינתטיים באמצעות מערכת ביטוי ללא תאים.המעבדה שלי עובדת על בנייה מחדש של תעלות יונים שונות בתאים סינתטיים באמצעות בנייה מחדש של פוטנציאל הפעולה על ידי קבוצה מוגדרת היטב של תעלות יונים.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

790 Views.  University of Michigan, Ann Arbor. הפרוטוקול שלנו מתייחס להרכבה מחדש של חלבון ממברנה בתוך דו-שכבת השומנים של תא סינתטי שנעשה בשיטת תחליב טיפות הפוך. היתרון בשימוש בשיטת תחליב טיפות הפוך הוא ביכולתה לייצר תאים סינתטיים המספקים סביבה יציבה לביטוי תאי של חלבוני ממברנה. הפרוטוקול שלנו מציע שיטה חזקה לחוקרים בת...

Video: מחבר זרקור: מבנה מחדש של חלבון ממברנה בתאים סינתטיים

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

תגובות ביטוי נטולות תאים בתפזורת עם שלפוחיות יונילמלריות קטנות (SUV) עבור יישומי תאים סינתטיים

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.