כדי להתחיל, הכן את תמיסת החיץ החיצוני של GUV בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מעורבב יחד זרעונים, ATP, GTP, CTP, UTP, קריאטין פוספט, מגנזיום אצטט, אשלגן גלוטמט, HEPES, אשלגן הידרוקסיד, חומצה פולינית. גלוקוז, ומלאי חומצות אמינו.
הוסף מים מטוהרים במיוחד כדי להביא את הנפח הסופי של התמיסה למיליליטר אחד. לאחר מכן, במכסה אדים, הוסף 17.3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי POPC לבקבוקון זכוכית של 15 מיליליטר. לשם כך, פיפטה 1.08 מיקרוליטר של קופולימר PEO-b-PBD.
נשפו בזהירות זרם עדין של גז ארגון לתוך בקבוקון הזכוכית תוך כדי סיבוב הבקבוקון כדי לאדות את הכלורופורם. ואז פיפטה 1.2 מיליליטר של שמן מינרלי קל לתוך בקבוקון זכוכית. מערבלים את השומנים והשמן במהירות מרבית למשך 10 עד 20 שניות.
הכניסו את בקבוקון הזכוכית לתנור בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני ערבול למשך 10 עד 20 שניות נוספות במהירות מרבית. לאחר מכן, פיפטה 270 מיקרוליטר של הפתרון החיצוני GUV לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לשם כך, פיפטה 15 מיקרוליטר כל אחד של חמישה נתרן כלורי מולארי ו 4.5 אשלגן כלורי טוחן.
פיפטה עדינה 300 מיקרוליטר של תערובת שומנים ושמן על גבי התמיסה החיצונית של GUV. לאחר הדגירה, יש להרכיב תגובת CFE על ידי צנרת תמיסות 1 עד 3, קידוד פלסמיד DNA עבור sfGFP מסיס או גרסאות של קולטן גלוטמט sfGFP, RNAse מורין וסוכרוז טוחנת אחד לתוך בקבוקון. הוסף מים טהורים במיוחד deionized כדי להביא את נפח התגובה ל 20 מיקרוליטר.
הוסיפו 600 מיקרוליטר של תערובת שמן השומנים לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את תערובת התגובה של 20 מיקרוליטר. פיפטה למעלה ולמטה במרץ במשך דקה אחת כדי לדמות את התגובה. מניחים בעדינות את התחליב הפנימי על גבי שכבת השמן בצינור.
צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 2000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בזהירות פיפטה החוצה את עודף שמן פתרון חיצוני מן הצינור microcentrifuge. מערבבים בעדינות את גלולת ה-GUV בתמיסה הנותרת כדי להשעות אותה מחדש.
העבר את תמיסת ה- GUV לפלטה תחתונה שטוחה נקייה של 96 בארות לדגירה. מעבירים את הצלחת האטומה לקורא צלחות כדי לדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שש שעות. לאחר הדגירה, מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
התמקדו באזור מעניין המכיל את ה-GUVs, ולאחר מכן לכדו את התמונות באורך גל עירור של 488 ננומטר. שמור את התמונות בתבנית TIFF. פתח את התמונות בתוכנת עיבוד תמונה.
לחץ על לוח ההגדרות בהירות/ניגודיות כדי לפתוח אותו. לאחר מכן התאם את הבהירות והניגודיות כדי להפוך את החלבונים הפלואורסצנטיים לגלויים. תגובות הביטוי נטולות התאים של קולטן גלוטמט מסוג פראי העטופות ב- GUV הדגימו ביטוי מעולה ולוקליזציה של הממברנה.
קולטן PRSP-גלוטמט היה נוטה לצבירה והיווצרות ניקוב. sfGFP המסיס בא לידי ביטוי ב- GUVS ונשאר בלומן GUV.
