ייצור AAV רקומביננטי על ידי Transient Transfection

כדי להתחיל, צלחת HEK293T תאים על ידי הוספת 22 מיליליטר של מדיום תרבית תוספת ב 10 צלחות תרבית מטופלות בקוטר 15 סנטימטרים. דוגרים על הצלחות במשך 24 שעות כדי להגיע למפגש של 70% עד 80%. עבור transfection התא, להכין תערובת על ידי שילוב ריאגנטים בצינור microcentrifuge וערבוב על ידי הקשה.

הוסף את תערובת הטרנספקציה ל- 4.56 מיליליטר DMEM ללא תוספת בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר וערבב על ידי הקשה. לאחר מכן, להוסיף 1.37 מיליליטר של פתרון פוליאתילנימין סטרילי טיפה אחר טיפה. יש לערבב על ידי הקשה ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ליצירת קומפלקסים של DNA פוליאתילניאמין.

הוסיפו את התערובת ל-231 מיליליטר של תוסף DMEM שחומם מראש. החליפו את מדיום התרבית בכל צלחת תרבית ב-22 מיליליטר של תערובת טרנספקציה זו, ודגרו על התאים במשך 48 שעות. אם PITR מקודד כתב פלואורסצנטי, התבונן בתאים הנגועים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לאחר מכן, לאסוף את המדיום מכל מנה. צנטריפוגה ב 800G למשך 10 דקות ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של PBS שחומם מראש לצלחת והשתמש במגרד תאים כדי להסיר את התאים.

אספו את מתלה התא לתוך צינורות הצנטריפוגות המכילים את גלולת התא. ודא שכל התאים נאספים על ידי שטיפת חמש כלים בכל פעם עם 10 מיליליטר של PBS. שוב צנטריפוגה כדי לגרש את התאים.

עבור מיצוי rAAV, הפשיר את כדורי התא הנגועים והשהה מחדש ב -100 מיליליטר של חיץ סטרילי ופיפטה כדי להבטיח השעיה הומוגנית. לאחר מכן, הוסיפו 12.5 מיליליטר של תמיסת 10% נתרן דאוקסיכולאט טרייה וסטרילית כדי לגרום לליזה של התא וערבבו על ידי פיפטטינג. מוסיפים 27 מיקרוליטר של נוקלאז בנזונאז ומערבבים היטב עד שהתערובת כבר לא צמיגה.

דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מערבלים כל 10 דקות, למשך שעה. צנטריפוגה ב 3, 000G במשך 60 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. סננו את הסופרנאטנט באמצעות מסנן מזרק PVDF בגודל 0.45 מיקרון לתוך מיכל סטרילי חדש.