כדי להתחיל, הכן את מערכת FPLC לטיהור. שטפו ביסודיות את נתיב זרימת הנוזל במים סטריליים טהורים במיוחד באמצעות הוראות ידניות או בשיטה מותאמת אישית. חבר עמוד הפרין ארוז מראש של מיליליטר אחד.
כוונן את אזעקת הלחץ. ולשטוף עם חמישה נפחים עמודה של מים טהורים במיוחד בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן החלף את הפתרונות עבור משאבות מערכת כדי להתכונן ליישום לדוגמה.
שטפו את משאבת המערכת B עם חיץ B ומלאו את שאר נתיב זרימת הנוזל בחיץ A.הכניסו את צינור הדגימה של משאבת הדגימה לתכשיר הנגיפי. לחלופין, השתמש בלולאה סופר עבור הדגימה. הכנס את צינורות היציאה למיכל חדש.
בעת ביצוע הטיהור בפעם הראשונה, הגדר שיטה מותאמת אישית לטיהור אוטומטי. לאחר הפעלת הגדרות הטיהור הכלליות, השיטה תנהל את נתיב הזרימה מכניסת הדגימה S1 לשסתום ההזרקה עם תמיסת הדגימה. לאחר מכן אזנו את העמודה עם סך של חמישה נפחי עמודות באמצעות 12.5% של מאגר B בקצב של מיליליטר אחד לדקה.
החל את המדגם על העמודה ב 0.5 מיליליטר לדקה ולאסוף את הזרימה באמצעות יציאת היציאה. שטף את העמודה עם 20 נפחי עמודות של Buffer A במיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן לחקות את המדגם במיליליטר אחד לדקה עם תוכנית זו.
בחר כדי לאסוף את הדגימה המדוללת בשברים של מיליליטר אחד באמצעות אוסף שברים. לאחר מכן אזנו מחדש את העמודה במיליליטר אחד לדקה עם 12.5% של מאגר B עבור חמישה נפחי עמודות. פתח את השיטה שנוצרה והמתן לשלב elution.
אסוף את השברים באמצעות אוסף שברים. כמו כן, לאסוף aliquot של הזרימה דרך ולאחסן את השברים במינוס 20 מעלות צלזיוס. הערך את הכרומטוגרמה שנשמרה באופן אוטומטי של כל שלבי הטיהור.
כולל פרופיל האלוציה. לאחר השלמתה, העבר את הפתחים מתמיסות החיץ למים טהורים במיוחד ושטוף את העמוד במיליליטר אחד לדקה במשך חמישה נפחי עמודות. שחזור העמודה, החליפו את הפתחים ממים טהורים במיוחד לאתנול 20% ושטפו את העמוד במשך חמישה נפחי עמודות.
כדי לרכז rAAVs, טען את שברי ה- FPLC הרצויים ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 15 מיליליטר עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון. צנטריפוגה ב 2, 000 גרם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי להגיע נפח מרוכז של כ 500 מיקרוליטר. המשך עם החלפת חיץ על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי ליחידת המסנן הצנטריפוגלי.
שטפו את הפילטר על ידי פיפטציה. וצנטריפוגה במרווחים של דקה עד הגעה לנפח של 500 מיקרוליטר. רכז עוד יותר את rAAVs על ידי העברת דגימה זו של 500 מיקרוליטר ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 0.5 מיליליטר עם חיתוך של 100 קילודלטון.
וצנטריפוגה ב 6, 000 G במשך מרווחים של דקה אחת עד נפח הוא פחות מ 100 מיקרוליטר. שחזר את ה- rAAV המרוכז על ידי הפיכת התקן המסנן לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש, וצנטריפוגה כדי להעביר את ה- rAAV לתוך הצינור. יש להכניס את ה-rAAV לצינורות מיקרו-צנטריפוגות בעלי שימור נמוך ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.
טוהר תכשירי rAAV נותח באמצעות דף SDS, וחשף רצועות חלבון קפסיד נפרדות. הדמיה של חלקיקים נגיפיים על ידי TEM הראתה חלקיקים ריקים עם מרכז צפוף אלקטרונים וחלקיקים מלאים. הערכת תכונות הטומאה הפיזית של rAAV באמצעות פלטפורמת הפעלולים חשפה חלקיקי קפסיד שלמים בסביבות 30 ננומטר, טיטר קפסיד כולל, חלבון חופשי ומצטבר, ודנ"א חד-גדילי.
בדיקות זיהומיות בתאי נוירו 2a הראו רמות זיהומיות גבוהות. הודגמו תרביות עצביות ראשוניות שנדבקו בתכשירים הנגיפיים. תכונות העברת גנים שמורות.
התמרה In vivo של המוח הקטן של עכברים עם וקטורי rAAV הביאה לביטוי GFP ממושך. מצביע על ביטוי טרנסגני מוצלח במוח היונקים.
