כדי להתחיל, הניחו את צלחות ההדמיה הבינונית והסטרילית שחוממו מראש עם משטחי זכוכית מצופים או לא מצופים על משטח עבודה. לאחר הסרת התווך המקיף את תבנית האגרוז, יש להשהות בזהירות את תכולת התבניות במדיה של 190 מיקרוליטר לפני העברת ספרואידים צפים לבקבוקון של שני מיליליטר. עבור ספרואידים בצלחת בעלת חיבור נמוך, העבירו ספרואידים בזה אחר זה מבארות בודדות לבקבוקון.
אפשרו לכדוריות להתיישב בתחתית הבקבוקון למשך חמש דקות, ויצרו גלולה גלויה. הסר את המדיה מהבקבוקון, משאיר את הספרואידים ללא הפרעה, והשהה אותם מחדש בעדינות בכמות מספקת של מדיום 5A טרי של McCoy. כעת, העבירו נפח שווה של תרחיף ספרואידי לכל באר של צלחת המיקרוסקופ.
לדגור על ספרואיד למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. הוסף בדיקה פלואורסצנטית לנפח ידוע של תרחיף ספרואידי והמשך הדגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להחליף את המדיה המכילה בדיקות פלואורסצנטיות עם נפח הכרחי של מדיה הדמיה.
הפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ ואתחל את כיול השלבים. לאחר מכן, בחר את המטרה הנדרשת. בחר בחלון פתח פרוייקט ולחץ על צור פרוייקט חדש.
לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על הפרויקט החדש שנוצר ובחר את שנה שם אפשרות בתפריט הנפתח. תן שם סטנדרטי לקובץ פרויקט המחקר. פתח את החלון רכישה.
הגדר את הדופק, אורך גל עירור לייזר אור לבן ואת הטווח הנדרש של גלאי סריקה היברידיים או תהודה. לאחר מכן, בחר סוגי סריקה של קווים או מסגרות. בחלון רכישה, בחר במצב FLIM כדי לבצע הדמיה בשילוב עם ספירת פוטונים.
לאחר מכן, בחר את קצב החזרה של פולס לייזר אור לבן. התחל את הדמיית התצוגה המקדימה באמצעות מצב Fast Live והתאם את המיקוד העדין של אובייקט ההדמיה במקטע מעניין. על-ידי התבוננות בהיסטוגרמה של עוצמת הפיקסלים, התאם את גודל חור הסיכה והרזולוציה המתאימים בעוצמת הלייזר.
ב-Fast Live, הגדר את הקואורדינטות ואת כיוון הסריקה וייחסו אותן להתחלה ולסיום בחלון Z-Stack. בחר גודל z שלב או מספר שלבים. לאחר החלת כל ההגדרות הדרושות, התחל בהדמיה.
תן לתמונה שם מתאים ושמור את פרויקט ההדמיה. שיטות היווצרות שונות הביאו לגדלים שונים של ספרואידים. ספרואידים HCT116 בלוחות חיבור נמוכים היו גדולים משמעותית לאחר חמישה ימים בהשוואה לשיטות תפוקה גבוהה.
שיטות התקשרות נמוכות הובילו להתפתחות ברורה של ליבה נמקית שזוהתה על ידי צביעת יודיד פרופידיום. לעומת זאת, ספרואידים שנוצרו בשיטות אחרות הדגימו את הפיזור המפוזר של תאים מתים על פני גוף הספרואידים. חמצון ב HCT116 spheroids המיוצרים בשיטות שונות הראה יותר spheroid מחומצן עם microtissue ומיקרוmolds עשה מעבדה מאשר Sphericalplate 5D.
חמצון ספרואידי של ספרואידים 5D Sphericalplate הראה חמצון נמוך יותר בהשוואה למיקרו-רקמות ומיקרו-תבניות שיוצרו במעבדה. ניתוח Phasor של ספרואידים HCT116 שנעשו באמצעות לוחות חיבור נמוך מגלה את נוכחותן של ליבות גליקוליטיות ולא גליקוליטיות באמצעות שני פוטונים NADPH-FLIM.
