פיתוח תאי CAR-T המגיבים להיפוקסיה באמצעות התמרה לנטיויראלית

כדי להתחיל, מניחים בקבוקון של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בהקפאה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, העבירו את מתלה PBMC לצינור 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר TGM. צנטריפוגה את הצינור ב 300 G במשך חמש דקות לאחר pipeting החוצה aliquot של התא השעיה לספירה.

השהה מחדש את PBMC הכדורי בשלושה מיליליטר של TGM. לאחר מכן, להעביר את הנפח הנדרש של השעיית התא לתוך צלחת שש באר. יום לפני החייאה התא, להעביר 100 מיקרוליטר של אימונוגלובולין G עכבר חרוזים מגנטיים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

הוסיפו PBS של מיליליטר אחד לצינורות והניחו אותם על מעמד מגנטי כדי לשטוף את החרוזים. להשעות מחדש את החרוזים ב 100 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן להוסיף את הנוגדנים להשעיה.

השתמש פיפטה כדי לערבב בעדינות את המתלה היטב. הניחו את המתלים על נדנדה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שטיפת החרוזים ב- PBS כפי שנעשה קודם לכן, להשעות אותם מחדש ב 100 מיקרוליטר של PBS.

כעת מוסיפים חרוזי חיסון מצופים NHCD3 hCD28 לצלחת ודוגרים. לאחר 48 שעות של דגירה, מערבבים ומעבירים את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך שלוש דקות.

לאחר מכן מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר. זרעו חמש פעמים 10 בחזקת חמישה PBMC ב-300 מיקרוליטר TGM לתוך בארות של צלחת שטוחה 48. פיפטה 200 מיקרוליטר של מלאי lentiviral לתוך הבארות המתאימות.

לאחר מכן להוסיף פרוטאמין סולפט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לפני צנטריפוגה. פיפטה מוציאה 300 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל באר, ואז מוסיפה מיליליטר אחד של TGM טרי לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני.

מוסיפים לצלחת 0.5 עד שני מיליליטר TGM טריים כל יומיים-שלושה. לאחר מכן מעבירים את התאים לצלחת באר 12, ואחריה צלחת שש בארות עד שצפיפות התאים הכוללת מגיעה ל -6 מיליון בנפח של ארבעה מיליליטר.