אנו מודים לג&#39;יימס Perna להמחשה הגרפית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש לYZ

אישור צריך להיות ממוסדים הביתה לפני תחילתו של הניתוח ומחקר הדמיה. ניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות מאוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז מוסדי הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. 1. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי כל מכשירי הניתוח ולעקר את סביבת העבודה עם אלכוהול 70% ביסודיות לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal הזרקה (IP) של פתרון KX הרדמה (200 מ&quot;ג / קטמין קילוגרם ו20 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine) בהתאם למשקל גופו של עכבר הערה:. מינון KX יכול להיות מותאם על פי הזן, הגיל ומצב בריאות של העכברים. התייעצות וטרינרית כדי לקבוע את המינון האופטימלי מומלצת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת הבוהן קמצוץ מעת לעת על ידי לחיצה על בוהן של העכבר ובדיקת תגובה רפלקסיבית לנטר את מצב ההרדמה.ודא שהעכבר הוא בהרדמה מלאה לפני תחילת ניתוח הערה:. במהלך פגישות הדמיה ממושכות, לבדוק את מצב ההרדמה של העכבר מעת לעת, לנהל KX נוסף במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש של העכבר באמצעות סכין גילוח כדי לחשוף את הקרקפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את האזור המגולח ידי מנגב את העור עם לסירוגין רפידות אלכוהול ובטאדין. הסר את כל גזירות שיער שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל משחה העין כדי לשמן את שני העיניים, ולכן מניעת ניזק בלתי הפיך הנגרם על ידי התייבשות במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת, ולהעביר את העור רוחבי לכיוון הקצוות של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רקמת החיבור הצמודה לגולגולת. </li></ol> 2. דליל, גולגולת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אזור ההדמיה המבוסס על ster. קואורדינטות eotaxic הערה: נסה להימנע מכלי דם גדולים, שחדירה לחסום אור ולטשטש את מבני הדמיה. בכלי דם הוא ציין הטוב ביותר כאשר הגולגולת לחה עם תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתרגיל מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל אזור מעגלי של גולגולת (0.5-1.0 מ&quot;מ קוטר). העבר את התרגיל המקביל למשטח הגולגולת, ולא מחזיק את זה נגד הגולגולת ולחיצה. מקדחה עד ששתי השכבה החיצונית הקומפקטית עצם ושכבת עצם הספוגית האמצע יוסרו הערה:. כדי למנוע נזק שנגרם על ידי התחממות יתר, להימנע ממגע ממושך בין המקדח והגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דילול שכבת העצם הקומפקטי הפנימית עם להב microsurgical במרכז האזור-דליל התרגיל. החזק את להב microsurgical בזווית של כ 45 ° כדי לגרד את הגולגולת בלי לחיצה על הגולגולת באופן שווה עד דליל אזור קטן (200-300 בקוטר מיקרומטר) בעובי של משוערמיקרומטר ly 20-30 מתקבל. בשל אוטומטי הקרינה של הגולגולת, העובי ניתן למדוד על ידי סריקה את המרחק בין משטח העליון ותחתון של הגולגולת מתחת לשני פוטונים מיקרוסקופ הערה:. למרות עובי גולגולת של פחות מ 20 מיקרומטר מספק איכות הדמיה טובה, זה לא מומלץ, כי זה הופך את תהליך ההרזיה בהפעלות מחדש הדמיה הבאות קשה. כדי להימנע מעל דליל, העובי של הגולגולת צריך להיבדק מעת לעת במהלך הניתוח (ראה דיון). </li></ol> 3. קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את עצם פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate בכל קצה של פתיחת מרכז צלחת ראש סטרילית, אשר כבר autoclaved (ראה איור 1). החזק את הצלחת בראש בחוזקה נגד הגולגולת עם האזור דליל הממוקם במרכזה של פתיחת הערה:. אם הדבק מזהם את r דלילegion במקרה, הסר אותה בזהירות עם להב microsurgical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את העור מן הצדדים של הגולגולת לקצוות של פתיחת מרכז צלחת הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כ10 דקות עד שצלחת הראש מצורפת גם לגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על ראש שני בלוקים לרוחב של הצלחת החזקה ולאחר מכן הדקתי את הברגים על הקצוות של צלחת הראש כדי לשתק את העכבר על צלחת ההחזקה (ראה איור 1) הערה:. ודא שאין עור או שפם בין צלחת הראש והלוקים לפני הידוק הברגים. הכנה משותקת טובה צריכה להראות שום תנועה הנצפית של הגולגולת מתחת למיקרוסקופ לנתח כאשר החלק האחורי של בעל החיים הוא טפח בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . יש לשטוף את הגולגולת חשופה עם מי מלח כדי להסיר את דבק unpolymerized הערה: חשוב כדי להסיר כל דבק שנותר, כדבק unpolymerized מטשטש תמונות ונזקים מיקרוסקופ מטרות &lt;./ Li&gt; </ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונה של כלי הדם של הגולגולת חשופה עם האזור דליל כמו מפה 1, המשמש למיקום מחדש של האזור צילם בפגישות הדמיה הבאות (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ההדמיה. אתר את האזור דליל תחת מטרת מיזוג 10X באמצעות epifluorescence ולהזיז את האזור הדק ביותר למרכז התצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של תמיסת מלח בחלק העליון של הגולגולת ולעבור למטרת 60x, אשר כבר שטפה עם מים סטריליים. בחר אזור בו קוצים הדנדריטים בודדים בבירור הם דמיינו לאורך הדנדריטים. לזהות ולתייג את האזור המקביל ב -1 במפה על ידי השוואת כלי דם בין תצוגת epifluorescent והתמונה בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגינת הלייזר באורך גל שני פוטונים פי fluorophores. לדוגמא, 920 ננומטר לYFP; 890 ננומטר של ה-GFP; 1,000 ננומטר לDsRed ו24 tdTomato. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ערימות תמונה עם 2צעדי מיקרומטר לאורך ציר z באמצעות אובייקטיבי 60x. ערימת תמונה זו משתרעת על שטח של כ 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), והוא משמש כמפה 2 להעתקה במהלך פגישות הדמיה שלאחר מכן (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תשע ערימות תמונה בתוך מפה 2 שימוש בזום דיגיטלי 3X. כל ערימת תמונה משתרעת על שטח משוער של 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), עם 0.7 מיקרומטר צעדים לאורך ציר Z-הערה:. עוצמת הלייזר צריכה להיות מתחת 40 mW כאשר נמדדו בדגימות כדי למזער phototoxicity. </li></ol> 5. שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדמיה, בעדינות לנתק את הצלחת בראש מהגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את הגולגולת ואת העור כדי להסיר את כל הדבק שנותר הערה:. כל דבק שנותר על העור יגרום לגירויים ולהאט את החלמת עור בזמן שכל דבק שנותר בגולגולת יגרום לשחיקה של הגולגולת וngiogenesis בשכבת העצם גדלה לאחרונה, מה שהופך את ההעתקה הבאה ומחדש הדמיה קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגולגולת ואת העור עם מספר פעמים מלוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הקרקפת עם תפר כירורגי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החיה על כרית חימום בכלוב נפרד. לנהל משכך כאבים עצירות (0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) תת עורי כדי להקל על כאב שלאחר ניתוח. להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית לאחר החלמה מלאה. לפקח על בעלי החיים בשיתוף פעולה הדוק (לבדוק לפחות פעם ביום) עד שהחתך נרפא ותפרים יוסרו. להזריק הבא של משכך כאבים עצירות במידת הצורך. </li></ol> 6. Reimaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1-1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.1-3.6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר אזור צילם בעבר על ידי השוואת הדפוס בכלי הדם למפת 1 ודפוס סניף הדנדריטים למפת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם reimaging מתבצע בתוך 1 שבוע, חזור על שלב 2.3 כדי להסיר את השכבה דקה של עצם גדל עתה על גבי מחדש דלילגיון באמצעות להב microsurgical. אם reimaging מבוצע לאחר שבוע יותר מ 1, חזור על שלבי שני 2.2 ו2.3 הערה:. שכבת העצם גדלה חדש מורכבת ממבנה מרוכז פחות בהשוואה לשכבה המקורית הקומפקטית העצם, מה שמוביל לאיכות תמונה מופחתת. לכן, כדי לרכוש את אותה האיכות, יש צורך לדלל את הגולגולת מעט יותר מפגישת ההדמיה הקודמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום ואת הכיוון כדי להשיג ערימות תמונה התואמות נלקחו בעבר ערימות תמונה מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות כמו בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.1-5.5 לאחר הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li><li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+plasticity+in+the+motor+cortex.">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li><li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+plasticity:+looking+beyond+development.">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li><li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+and+long-term+plasticity.">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li><li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging.">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories.">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li><li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo.">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li><li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis.">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li><li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices.">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li><li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization.">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li><li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation.">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window.">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li><li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כדי להשיג הכנה דלילה, גולגולת מוצלחת, כמה צעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. 1) העובי של הגולגולת. יש עצם גולגולת מבנה כריך, עם שתי שכבות של עצם קומפקטי בצפיפות גבוהה ושכבה אמצעית של עצם ספוגי בצפיפות נמוכה. בעוד תרגיל מיקרו במהירות גבוהה הוא מתאים להסרת השכבות החיצוניות של עצם קומפקטי ועצם ספוגי, להב microsurgical הוא אידיאלי לדילול השכבה הפנימית של עצם קומפקטי. כעובי וקשיחות של עליות הגולגולת במהלך פיתוח, הדמיה של עכברים בוגרים דורשת עצם יותר שיש להסירו כדי להשיג תמונות באיכות טובה. האזור דליל מציג מראה שקוף מוצק ומספק איכות הדמיה טובה כאשר העובי של הגולגולת הוא כ 20-30 מיקרומטר. עובי הגולגולת יש לבדוק מעת לעת במהלך תהליך הדילול כמו שעושה מעל לדילול תהליך הדילול במפגשי reimaging שלאחר מכן קשה. 2) הגודל של האזור דליל.חשוב לקבוע תצורה דלילה, גולגולת יציבה, שבו חלל כמו קונוס-מושגת. הארכיטקטורה של האזור דליל בגודל נכון מונעת גרימת נזק לקליפת המוח ומסייעת לדילול בהפעלות מחדש הדמיה הבאות. מומלץ להפוך את האזור התחתון (כ 200-300 מיקרומטר קוטר) של האזור דליל יותר קטן מהפתח העליון (כ 0.5-1.0 מ&quot;מ בקוטר). 3) היציבות של התמונות. הכנה משותקת היטב מסייעת לשפר את איכות תמונה על ידי הקטנת חפצי תנועה המושרית בדרכי הנשימה. זה חשוב לשמור את הגולגולת יבשה ונטול רקמת חיבור ועצם פסולת לפני צלחת הראש מחוברת לגולגולת. דבק נוסף יכול להיות מיושם גם כדי למלא את הפערים שנותרו בין צלחת הראש והגולגולת. בנוסף, מיקוד באזור מכלי דם גדול גם ממזער את התנועות הנגרמות על ידי שאיבת דם. חקירה של השינויים בחזייהבחי חיות עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים דורש דור של חלון אופטי. בנוסף להכנה דלילה, גולגולת, יכולים גם להיות דמיינו מבנים שכותרתו fluorescently ידי הסרת הגולגולת והחלפתו בכיסוי זכוכית (בדרך כלל 3-5 מ&quot;מ בקוטר) המספקת חלון ברור הדמיה 10, 13. בעוד שני דליל, גולגולת ופרוטוקולי הדמיה פתוחה גולגולת מיושמות באופן נרחב במחקרי הדמיה vivo, לכל שיטה יש יתרונות משלה והוא מתאים לעיצובים ניסיוניים שונים. לדוגמא, ההכנה הפתוחה הגולגולת היא שימושית עבור מחקרים שיחקרו שטחים גדולים יחסית במוח (למשל, בקוטר 5 מ&quot;מ) ודורשים פגישות הדמיה רבות עם מרווחי זמן קצרים (כלומר, ימים). ברגע שהחלון גולגולתי הוא מושתל בהצלחה, אין צורך בניתוח נוסף. עם זאת, התקופה שלאחר ניתוח (בדרך כלל כ 1 חודש) נדרש לפני ההדמיה הראשונהפגישה כדי לשפר תגובות דלקתיות פוטנציאליות הנגרמות על ידי ניתוח. Re-ההדמיה הופכת לבלתי אפשרית כאשר החלון גולגולתי חסום על ידי צמיחה מחודשת של העצם ו / או עיבוי של קרומי המוח. לעומת זאת, בעלי חיים עם הכנה דלילה, גולגולת יכולים להיות צילמו מייד לאחר הניתוח הראשוני, מה שהופך אותו מתאים יותר להדמיה כרונית של בעלי חיים צעירים יותר (לדוגמא, 2 שבועות). זה מתאים לחקירה עם מרווחים ארוכי הדמיה (כלומר חודשים עד שנים), כעיבוי לצמיחה מחודשת עצם והדורה הוא לא בעייתי. עם זאת, מחדש דליל של הגולגולת נדרש בדרך כלל עבור הפעלות מחדש הדמיה הבאות (מרווחי יום גם עם 2) בשל צמיחה מחודשת העצם. יתר על כן, שכבת העצם גדלה חדש מורכב ממבנה מרוכז פחות בהשוואה לעצם הקומפקטי המקורי, מקטין מאוד את השקיפות של האזור דליל, הגולגולת. לכן, כדי לרכוש את אותה האיכות של תמונות, יש צורך להסיר את שכבת העצם גדלה חדש לחלוטין. וכאלהttempts בדרך כלל להוביל לעובי הסופי של הגולגולת בהדמיה הבאה דקה יותר מההכנה הקודמת. מאז עובי הגולגולת היה מוכן 20-30 מיקרומטר בפגישה ההדמיה הראשונית, משאיר מקום מוגבל מחדש דליל, הפעמים ההדמיה הכוללת של הכנה דלילה, גולגולת היא בדרך כלל פחות מ -5 פעמים. לאחרונה, גישה ניסויית חדשה בשם מלוטש וחיזק דלילה, גולגולת (יציאות) פותחה כדי לשלב את שני ההכנות דלילים, ופתוחה גולגולת 11, 26, 27. עד כה, רוב in vivo הדמיה בקליפת המוח שבוצע באמצעות קווי עכבר מהונדסים להביע EGFP או YFP תחת אמרגן Thy1 הספציפי עצבי. עכברים מהונדסים אלה מבטאים חלבוני ניאון בדלילות בקבוצת משנה, אבל אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב בקליפת המוח 25. מאז קווים רבים של ראיות מצביעים על כך שפלסטיות מבנית חוויה תלויה קורה בSeleסוגי תאי ctive של מעגלים מוגדרים היטב, חשוב לתייג ותמונה בצורה תאים מסוג מסוימת. עד כה, גישות רבות יושמו כדי להשיג מטרה זו. לדוגמא, נוירונים פירמידליים בשכבות בקליפת המוח שונות יכולים להיות ממוקדים על ידי ביצוע ב electroporation ברחם בשלבים מוגדרים עובריים 28, 29. כמו כן, זריקה של וקטורים ויראליים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי יכולה לשמש גם לתייג תאים באזורי מוח שונים 30. בנוסף, קווים רבים של עכברים הטרנסגניים כבר נוצרו לנהוג הביטוי של recombinase Cre תחת יזמים סוג תא מסוימים ביום 31 ב, 32. הזרקה של וקטורים ויראליים כגון וירוס adeno הקשורים נושא גן כתב הניאון הבא קודון עצירת floxed לעכברים אלה מציעה את האפשרות למקד ברמה מסוימת של תאי עצב באזור הוגבלה 33. על ידי שילוב של התיוג החדש אלה מתקרב עם דליל, שלנוהכנת קול, שינויים בקשרים סינפטיים של נוירונים בקליפת המוח יכול להיחקר על ידי שני פוטונים בתחום ההדמיה vivo בסוג והתא / או צורת מעגל ספציפי. עם הזמינות הגוברת של בעלי חיים מהונדסים עם יכולים להיות מיושמים גם אוכלוסיות תאים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, נהלים דומים שתוארו כאן כדי לחקור סוגי תאים אחרים (תאי גליה) וכלי דם במוח החי. בשילוב עם מניפולציות התנהגותיות ומודלי מחלה, שני פוטונים בתחום ההדמיה vivo ירחיב במידה רבה את ההבנות של המנגנונים המולקולריים, תאיים, ואת המעגל שבבסיס תפקודי מוח שלנו.

היונקים הקליפה משתתפת בתפקודי מוח רבים, משליטת תפיסה והתנועה חושית לעיבוד מידע מופשט וקוגניציה. פונקציות שונות בקליפת המוח לבנות על מעגלים עצביים שונים, אשר מורכבים סוגים שונים של נוירונים תקשורת והחלפת מידע בסינפסות בודדות של. המבנה והתפקוד של סינפסות באופן עקבי להיות שונה בתגובה לחוויות ופתולוגיות. במוח הבוגר, פלסטיות הסינפטית לובשת צורה של שני שינויי כוח ובנוסף / הסרה של סינפסות, ממלאת תפקידים חשובים ביצירת ותחזוקה של מעגלים עצביים פונקציונליים. קוצים הדנדריטים הם רכיבי postsynaptic של רוב סינפסות מעוררות במוח של היונקים. התחלופה המתמדת ושינויים מורפולוגיים של קוצים הם האמינו לשמש אינדיקטור טוב של שינויים בקשרים סינפטיים 1-7. מיקרו לייזר סריקת שני פוטוניםscopy מציע חדירה עמוקה דרך, הכנות אטומות עבות וphototoxicity הנמוך, מה שהופך אותו מתאים להדמיה לחיות במוח שלם 8. בשילוב עם תיוג פלורסנט, שני פוטונים הדמיה מספקת כלי רב עוצמה כדי להציץ לתוך המוח החי ופעל לארגון מחדש מבני בסינפסות בודדות עם גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. שיטות שונות שימשו להכנת עכברי הדמיה לחיות 9-13. כאן, אנו מתארים הכנה דלילה, גולגולת של in vivo שני פוטונים הדמיה כדי לחקור את הפלסטיות המבנית של קוצים הדנדריטים postsynaptic בקליפת מוח העכבר. שימוש בגישה זו, המחקרים האחרונים שלנו תיארו תמונה דינמית של שינויים בעמוד השדרה הדנדריטים בתגובה למיומנות מוטורית לומדת עם זמינות גוברת של בעלי חיים מהונדסים עם תת נוירונים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, יכולים להיות מיושמים גם נהלים דומים שתוארו כאן לחקירהסוגי te תאים אחרים ואזורים בקליפת המוח, בשילוב עם מניפולציות אחרות, כמו גם בשימוש במודלים של מחלת 16-23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1253">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Ketamine</td>
			<td style="width:181px;">Bioniche Pharma</td>
			<td style="width:108px;">67457-034-10</td>
			<td style="width:775px;">Mixed with xylazine for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Xylazine</td>
			<td style="width:181px;">Lloyd laboratories</td>
			<td style="width:108px;">139-236</td>
			<td>Mixed with ketamine for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Saline</td>
			<td style="width:181px;">Hospira</td>
			<td style="width:108px;">0409-7983-09</td>
			<td>0.9% NaCl for injection and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Razor blades</td>
			<td style="width:181px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:108px;">72000</td>
			<td>Double-edge stainless steel razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Alcohol pads</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">06-669-62</td>
			<td>Sterile alcohol prep pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:181px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:108px;">102-9470</td>
			<td>Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">High-speed micro drill</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:108px;">18000-17</td>
			<td>The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Micro drill steel burrs</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:108px;">19007-14</td>
			<td>1.4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Microsurgical blade</td>
			<td style="width:181px;">Surgistar</td>
			<td style="width:108px;">6961</td>
			<td>The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">NC9062131</td>
			<td>Fix the head plate onto the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Suture</td>
			<td style="width:181px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:108px;">510461</td>
			<td>Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">CCD camera</td>
			<td>Infinity</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Two-photon microscope</td>
			<td style="width:181px;">Prairie Technologies</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:775px;">Ultima IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">10X objective</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>NA 0.30, air</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">60X objective</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>NA 1.1, IR permeable, water immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Ti-sapphire laser</td>
			<td style="width:181px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>Mai Tai HP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex using a thinned-skull preparation

בקליפת המוח של היונקים, תאי עצב יוצרים רשתות מאוד מסובכות ולהחליף מידע בסינפסות. שינויים בחוזק סינפטי, כמו גם תוספת / הסרה של סינפסות, מתרחשים באופן חוויה תלויה, המספקים את היסוד המבני של פלסטיות עצבית. כרכיבי postsynaptic של סינפסות המעוררות ביותר בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים נחשבים פרוקסי טוב של סינפסות. יתרונות לוקחים גנטיקה עכבר וטכניקות תיוג פלורסנט, נוירונים בודדים והמבנים הסינפטי שלהם יכולים להיות מתויגים במוח שלם. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה transcranial באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים לעקוב קוצים שכותרתו fluorescently postsynaptic הדנדריטים לאורך זמן in vivo. פרוטוקול זה משתמש בהכנה דלילה, גולגולת, אשר משומרת על הגולגולת שלמה ותמנע תופעות דלקתיות הנגרמות על ידי חשיפה של קרומי המוח וקליפת המוח. לכן, ניתן לרכוש תמונות מייד לאחר surgery מתבצע. הליך הניסוי ניתן לבצע שוב ושוב על פני מרווחי זמן שונים, החל משעות לשנים. היישום של הכנה זו גם ניתן להרחיב כדי לחקור אזורים שונים בקליפת המוח ושכבות, כמו גם סוגי תאים אחרים, בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

בעכברי שורת YFP-H 25, חלבון פלואורסצנטי צהוב מבטא בקבוצת משנה של נוירונים פירמידליים בשכבת V, אשר פרויקט דנדריטים קודקודם לשכבות השטחיות בקליפת המוח. דרך ההכנה דלילה, הגולגולת, מגזרים הדנדריטים שכותרתו fluorescently יכולים להיות צילמו שוב ושוב מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים על מרווחי הדמיה שונים, הנעים בין שעות לחודשים. כאן אנו מראים דוגמא להדמיה של אותו דנדריטים מעל 8 ימים בקליפת המוח המוטורי של עכבר ישן 1 בחודש, שבו עמוד השדרה פרט, כמו גם filopodia ניתן דמיינו לאורך דנדריט בבירור ארבע פעמים. בדרך כלל, את העומק של ערימות תמונה הוא כ 100-200 מיקרומטר משטח pial. ניתן לבצע ניתוחים שונים המבוססים על התמונות האלה. לדוגמא, היווצרות עמוד השדרה, החיסול והתחלופה ניתן לכמת על ידי השוואת תמונות ממפגשים שונים. צפיפות עמוד השדרה יכולה להיות מחושבת על ידי חלוקת מספר הקוצים באורך של dendritקטע ic. שינויים של תנועתיות עמוד השדרה ומורפולוגיה גם ניתן לנתח. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51520/51520fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51520/51520fig1.jpg" /> איור 1. צלחות מחוייט קיבוע של הכנה דלילה, גולגולת לשני פוטונים בתחום ההדמיה vivo. () תצלום של צלחת הראש, אשר עשויה משניים או שלושה סכיני גילוח דבוקים יחד, עם קצוות חדים המכוסים בקלטות. (ב) תצלום של צלחת האחזקה, אשר מורכבת מצלחת 1 נירוסטה, 2 בלוקים מפלדה אל חלד, 2 ברגים, ו2 מפרידי. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51520/51520fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הדמיה שני פוטונים Transcranial דרך הכנה דלילה, גולגולת בקליפת המוח המוטורית העכבר, <sטרונג&gt; מראה דינמיקה של קוצים הדנדריטים יותר משמונה ימים. () CCD תמונה של תבנית כלי הדם באזור דליל הגולגולת (מפת 1). הקופסה השחורה מציינת את האזור שבו שני פוטונים בתמונות vivo נרכשו. (ב) היטל מרבי נמוכה ההגדלה של סניפים הדנדריטים בקליפת המוח המוטורית של עכבר ישן 1 חודש (מפה 2). (C) תמונות חוזרות ונשנות של אותו קטע הדנדריטים לחשוף קוצים שהוקמו זה עתה (ראשי חץ), קוצים בוטלו (חיצים), וfilopodia (כוכבים) ביום 0, 2, 4, ו -8. הלוח השמאלי הוא תצוגה גבוהה יותר ההגדלה של המגזר הדנדריטים מוצג באזור התאגרף ב( ב &#39;). סולם ברים: 500 מיקרומטר (), 20 מיקרומטר (ב &#39;), ו2 מיקרומטר (C).

Watch this Scientific Journal Video about Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

17.8K Views.  University of California, Santa Cruz. Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Video: Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

טכניקת חלון קליפת מוח, גולגולת דקה יותר עבור<em&gt; In Vivo</em&gt; טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית הדמיה

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...