עבודה זו מומנה על ידי המרכז לגידול במוח הרמלין, בית החולים הנרי פורד.

1. השעיית תא יחיד מדגם גליובלסטומה כירורגי טרי לתרבות נוירוספרה
<ol><li>בהסכמה בכתב מהחולים ובהתאם להנחיות המוסדיות, לאסוף דגימות גידול לתרבות התא מיד לאחר ניתוח כריתה של גליומה בדרגה גבוהה.</li>
	<li>לאשר אבחנה של דגימת גידול על ידי היסטופתולוגיה. מיד להעביר את הדגימה מחדר הניתוח למכסה המנוע של רקמת זרימה למינאר, לעיבוד בתוך 1 שעה מניתוח. הערה: עבור ניתוחים באתר מרוחק, לחתוך את דגימת הגידול לתוך שברים קטנים יותר ומניחים לתוך צינור המכיל DMEM / F12 (לשמור על הקרח). הגידול יכול להיות מעובד מספר שעות לאחר הניתוח.</li>
	<li>החל 200-500 מ"ג של רקמה (אופטימלי), טחון את דגימת הגידול באמצעות להב אזמל, ולהעביר צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר DMEM / F12 בינוני ללא סרום. מערבבים על ידי היפוך מספר פעמים, לתת את חתיכות הגידול משקעים על ידי כוח הכבידה, להסיר בינוני, ולחזור לפי הצורך.</li>
	<li>הכינו את פתרון ניתוק הרקמות האנזימטי והפסיקו את הפתרון טרי.<ol>
<li>פתרון דיסוציאציה של רקמות אנזימטיות: 5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA, 2.5 מ"ל פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא סידן ומגנזיום, 2.5 מ"ל קולאזנאז IV פתרון מלאי (2,000 U/ml ב- HBSS עם סידן ומגנזיום).</li>
		<li>עצור פתרון: 5 מ"ל טריפסין מעכב פתרון, 5 מיליליטר DMEM / F12, 2 מיקרוליטר של 5,000 U / ml DNAse אני (עשה HBSS סידן ומגנזיום חינם).</li>
	</ol></li>
	<li>הסר בינוני ולהוסיף פתרון דיסוציאציה של רקמות אנזימטיות לדגימת הגידול הטחון, באמצעות 2 מ"ל עבור כל רקמה 0.5 גרם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.</li>
	<li>דגירה הרקמה בתמיסה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמה תחת סיבוב במשך 30 דקות.</li>
	<li>טריטוראט עם פיפטה 2 מ"ל ולהפסיק את העיכול או לחזור לאינקובטור עוד 15-30 דקות דגירה בהתאם לרמת העיכול.</li>
	<li>להפסיק את העיכול על ידי הוספת 2 כרכים של פתרון עצירה triturate מכני עם פיפטה סרולוגית 5 מ"ל.</li>
	<li>לסנן את החומר מעוכל באמצעות מסננת תאים 40 מיקרומטר. גלולה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו לשטוף 3x ב 10 מיליליטר DMEM / F12.</li>
	<li>Resuspend גלולת התא הסופי ב 5 מיליליטר DMEM / F12.</li>
	<li>לאט שכבת התא השעיה מעל 5 מ"ל של לימפולייט-M ו גלולה ב 1,300 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>העבר את שכבת הממשק המכילה את התאים הגרעיניים לצינור של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של DMEM/F12.</li>
	<li>גלולה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הכביסה עם DMEM/F12 פי 2 יותר.</li>
	<li>Cryopreserve תאים בודדים וכתוצאה מכך לשימוש נוסף על ידי שימוש חוזר גלולה בינונית הקפאת תא התאוששות, aliquoting לתוך cryovials, הקפאה איטית, ואחסון חנקן נוזלי.</li>
	<li>לתרבות, השוהים מחדש את התאים במדיום נוירוספרה בתוספת גורמי גדילה (NMGF), וצלחת בצפיפות נמוכה יחסית (<1 x 105 תאים / מיליליטר) בבקבוקון תרבית רקמת T25 רגיל בתנאים סטנדרטיים, 5% CO2, 37 °C (37 °F), חממת תרבית רקמות לחה (איור 1A).<ol>
<li>הכן NMGF באמצעות המתכון הבא<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">עבור 500 מ"ל של DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">פתרון מלאי</td>
					<td>נפח</td>
					<td>ריכוז סופי</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">תוספת N2 (10x)</td>
					<td>5 מ"ל</td>
					<td>פי 1</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 מ"ג / מ"ל BSA פתרון מלאי</td>
					<td>1 מ"ל</td>
					<td>0.5 מ"ג/מ"ל</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 מ"ג /מ"ל גנטמיצין מגיב</td>
					<td>1.25 מ"ל</td>
					<td>25 מיקרוגרם/מ"ל</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x אנטיביוטי/אנטי-מיקוטי</td>
					<td>2.5 מ"ל</td>
					<td>פי 0.5</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 מ"ג/מ"ל bFGF</td>
					<td>0.1 מ"ל</td>
					<td>20 ננוגרם/מ"ל</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 מ"ג/מ"ל EGF</td>
					<td>0.1 מ"ל</td>
					<td>20 ננוגרם/מ"ל</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>העבר נוירוספרות היוצרות מעל 1-3 שבועות (איורים 1B-E) לבקבוקים טריים, כדי להיפרד מתאים מחוברים ופסולת. בצע שינויי מדיה חלקיים כל 3-4 ימים. הערה: אם ניתוק גידול קסנוגרפט אורתוטופי באמצעות הפרוטוקול לעיל, שלבים 1.11-1.13 ניתן להשמיט.</li>
</ol>2. גליובלסטומה נוירוספרה תרבות תחזוקה ויישומים במורד הזרם
<ol><li>
דיסוציאציה: לפקח על תרבויות נוירוספרה ולבצע שינויים בינוניים חלקיים כל 3-4 ימים. כאשר רוב הנוירוספרות הרב-תאיות בבקבוק מגיעות לקוטר של 100 מיקרומטר, ניתוק להשעיית תא בודד:<ol>
<li>מעבירים את המדיום המכיל את הנוירוספרות לצינור של 15 מ"ל, משקעי כבידה הנוירוספרות במשך כ -5 דקות, מסירים את המדיום ומחדשים את גלולת התא ב- DPBS ללא סידן ומגנזיום של 10 מ"ל.</li>
		<li>מערבבים ומדגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כמו משקעים התאים על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>הסר 7-8 מ"ל של DPBS ולאחר מכן לנתק את הנוירוספרות מכנית עם פיפטה סרולוגית prewetted.</li>
		<li>גלולה התאים מנותקים ב 800 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Resuspend התאים מנותקים (שלב 2.1.) ב NMGF ולחלק למספר הדרוש של בקבוקונים (1:3), ולהדגיר בתנאים סטנדרטיים. נוירוספרות משניות ייווצרו, ויש לנתק אותן לאחר מכן להיווצרות ספירות שלישוניות.</li>
	<li>
הערכת התחדשות עצמית לטווח ארוך: חזור על הליך הדיסוציאציה עד שהתרבות הנוירוספרית תשיג לפחות 10 קטעים, שווה ערך למינימום של חודשיים בתרבות.</li>
	<li>
הקפאה: כדי cryopreserve את neurospheres, לנתק את neurospheres (שלב 2.1.) ולהזרים מחדש את גלולת התא בינוני הקפאת תא התאוששות, aliquot cryovials, להקפיא איטי, ולאחסן חנקן נוזלי.<ol>
<li>כדי תרבות תאים נוירוספריים ממלאי קפוא: להפשיר את התאים ב 37 °C (77 °F) ומיד להעביר צינור 15 מ"ל המכיל 10 מיליליטר DMEM / F12. מערבבים את הצינור בעדינות ולאחר מכן לסובב את התאים ב 800 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את גלולת התא עוד פעם אחת ו resuspend התאים NMGF ולהעביר בקבוק תרבות רקמה T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השעיית תאים עבור שתל תוך נדרי בעכבר immunocompromised:<ol>
<li>ניתוק הנוירוספרות (שלב 2.1) והתחדשו בכדור התא ב-DPBS נטול סידן ומגנזיום. לספור תאים קיימא באמצעות hemocytometer ו טריפאן הדרה כחולה.</li>
		<li>לחשב את מספר התאים הדרושים להשתלה, בדרך כלל 3 x 105 תאים / עכבר, להעביר את מספר התאים הרצוי לתוך בקבוקון, גלולה התאים ב 1,000 x g.</li>
		<li>השהה מחדש את גלולת התא בנפח המתאים לשתל (5 מיקרול / עכבר) על ידי הקשה עדינה על צינור microcentrifuge. מניחים את המתלה התא על קרח ולהשתמש בתוך 2 שעות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פרוטוקול חלופי עבור Culturing Tumorigenic גליובלסטומה תאים (במקרים שבהם התרבות הנוירוספרית נכשלת)
<ol><li>להשלים את המדיום NMGF עם סרום שור עוברי לריכוז הסופי של 2% FBS / NMGF.</li>
	<li>
החל מתאים בתרבות NMGF: קציר תאים קיימא מבקבוק NMGF(איור 1F),resuspend ב 2% FBS / NMGF וצלחת בצפיפות נמוכה יחסית (<1 x 105 תאים / מיליליטר) בבקבוק רגיל T25 רקמת תרבות, ותרבות בתנאים סטנדרטיים, 5% CO2, 37 °C (37 °C ), חממה תרבות רקמות לחות (איור 1G).</li>
	<li>
החל תאים קפואים מעולם לא בתרבית (שלב 1.14.): להפשיר את התאים, לשטוף בינוני ללא סרום צלחת ב 2% FBS / NMGF ותרבות כמתואר בשלב 3.2. Culturing ב NMGF במשך 3 ימים לפני העברת תאים קיימא 2% FBS / NMGF היא חלופה לבחור מראש משם תאים מובחנים.</li>
</ol>4. ניתוח מורפולוגי ומולקולרי של נוירוספרות על ידי אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>תרבות הנוירוספרות עד שרוב הכדורים הרב-תאיים הצפים מגיעים לקוטר של 100 מיקרומטר.</li>
	<li>הסר צלויי תרבות מהחממה ומיד גלולות נוירוספרות, להסיר בינוני ולהוסיף 10 מ"ל של DPBS מבלי להפריע גלולה. הסר DPBS, resuspend בפורמלין אגירה ניטרלי 10% דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>גלולה spheroids, resuspend ב 30% אתנול ודגרת במשך 30-45 דקות.</li>
	<li>החלף 30% אתנול עם 50% אתנול, דגירה במשך 15 דקות ולהחליף עם טרי 50% אתנול, דגירה עוד 30 דקות.</li>
	<li>חזור (שלב 4.4.) עם 70% אתנול.</li>
	<li>החלף עם 95% אתנול שני שינויים 10-20 דקות כל אחד, ולחזור עם אתנול מוחלט עד spheroids הם לבנים בהירים מרוכזים.</li>
	<li>הפוך חרוט נייר מסנן קטן מתוך נייר העדשה ומניחים אותו לתוך משפך קטן ב. הרטב את נייר העדשה באלכוהול מוחלט.</li>
	<li>לשחרר את גלולה מעט עם טרי 100% אתנול, לשפוך אתנול עודף ויוצקים את spheroids דרך חרוט נייר העדשה, לוודא שהם הולכים לקצה הקונוס. לשטוף את הצינור עם אתנול מוחלט נוסף ויוצקים את כל spheroids הנותרים דרך חרוט נייר העדשה.</li>
	<li>מוציאים את חרוט הנייר מהמשפך ומעבירים בזהירות את הכדורואידים לתחתית החרוט. מקפלים את הנייר לריבוע ומוודאים שהספרואידים סגורים בצורה מאובטחת ככל האפשר.</li>
	<li>מעבירים את הנוירוספרות הארוזות לקלטת ומעבירים למעבד רקמות אוטומטי.</li>
	<li>תוכנית מעבד הרקמות האוטומטי כדלקמן: אתנול מוחלט, 10 דקות, xylene, 15 דקות (2x), פרפין, 10 דקות (4x).</li>
	<li>הסר את הקלטת מהמעבד והנח אותה בחלק המחומם של מערכת הטמעת פרפין . ודאו שהמשטח כולו נקי מרסיסים, אבק או פסולת אחרת ושאבו את כל הפרפין מבארות החימום של המלקחיים. מחממים מלקחיים נקיים ללא פרפין ומוסיפים כמות קטנה של פרפין לתבנית בסיס מחוממת.</li>
	<li>פתח את הקלטת, הסר את המנה והנח אותה בחלק המחומם של מערכת ההטבעה. פתח בזהירות את חרוט הנייר עד שהספרואידים יהיו גלויים. לאסוף כמה שיותר של החומר ככל האפשר עם מלקחיים מראש ולהעביר את הפרפין הנוזלי בתבנית הבסיס.</li>
	<li>חזור על הפעולה כנדרש כדי לאחזר כמה שיותר ספירואידים. בעדינות לגרד את נייר הרקמה עם סכין גילוח נקי מראש כי כבר ניגב עם אתנול כדי לאסוף כל spheroids שיורית מבלי לקבל כל נייר לתוך הבלוק.</li>
	<li>בזהירות לשבור את כל גושים כדוריים עם מלקחיים חמים. מזיזים את הספרואידים מהפינות לשכבה מרכזית אחידה. מעבירים את תבנית הבסיס לאזור הקירור כדי לאבטח את הספארוידים במקום, מוסיפים את הקלטת, ממלאים לאט בפרפין ומצננים היטב.</li>
	<li>בלוק פרפין נוירוספרה יכול לשמש עבור חתך נורמלי אימונוהיסטוכימיה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro.">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas.">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li><li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li><li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo.">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma.">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li><li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria.">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li><li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours.">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype.">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li><li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

דיסוציאציה נכונה של תאי גידול אנזימטיים היא צעד קריטי בפרוטוקול זה. הרקמה חייבת להיות טחון הרבה לפני הדגירה בתמיסת דיסוציאציה של התא ב 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב, במשך מינימום של 30 דקות, כאשר הרקמה חייבת להיות משולש מכנית ואת הארכת הדיסוציאציה מאומתת. בהתאם למידת לכידות הרקמה, ניתן להאריך את הדגירה למשך 15-30 דקות נוספות, לפי הצורך כדי להשלים את הניתוק לתאים בודדים. דגירה בתמיסת דיסוציאציה במשך יותר משעה אינה מומלצת עקב ירידה בכדאיות התא. למרות הכמות האופטימלית של רקמה התחלתית היא 200-500 מ"ג, פרוטוקול זה הוביל תרבויות נוירוספרה מוצלחת מ קטן כמו 50 מ"ג של רקמת הגידול.
NMGF ללא סרום הוא מדיום סלקטיבי, ואחוז מהתאים הניאופלסטיים המרכיבים את עיקר הגידול, כמו גם תאים מארחים, לא ישרדו, בעוד שאחרים יתחברו לתרבות הרקמות שטופלה בבקבוקון לאחר הציפוי. זה קריטי כי נוירוספרות שייווצרו מעל 1-3 שבועות (איורים 1B-E) מועברים בקבוקונים טריים, להיפרד תאים סרטניים מובחנים ופסולת.
תאי GBM מנותקים אנזימטית ולעולם לא מתורבתים (שלב 1.10) יכולים להיות קריאופושמור כמקור גיבוי של תאים לתרבות במדיה אלטרנטיבית, במקרה שהתרבות הנוירוספרית נכשלת. השגנו בהצלחה תרבויות נוירוספריות ממלאי קפוא כזה, כמו גם תאים חד שכבתיים הגדלים ב-2% FBS/NMGF.
מבחינה מושגית, "תא גזע סרטני" הוא עבודה בתהליך ותחום מתפתח זה ייהנה מהבהרה נוספת, שכן ההשלכות הקליניות הן משמעותיות, במיוחד בדור של הטרוגניות הגידול, פלסטיות, והתנגדות לטיפול1 9,20. בנוסף להיותו חיוני ליצירת מודלים מסוימים של בעלי חיים GBM המטופל, תרבויות נוירוספרה הם גם בעלי ערך עבור מחקרים במבחנה כגון שינוי איתות התא ביטוי גנים בתגובה גורמי גדילה, היפוקסיה, וסוכניםתרופתיים 11,21. בחרנו להשתמש בחתכים של נוירוספרות משובצות פורמלין ופרפין, שמירה על ארכיטקטורת תלת-ממד, ללמוד ביטוי חלבון ושינויים פוסט-תרגומיים על ידי אימונוהיסטוכימיה11, בשל לוקליזציה תת-תאית מעולה ביחס לשיטה הנפוצה יותר של תיוג והדמיה של הספירה כולה.
הוכח כי לא כל התאים בתוך נוירוספרות נגזר המוח יונקים בוגרים הם תאי גזע22. באופן דומה, נוירוספרות מתורבת גידולים GBM סביר להניח לא שיבוט, בשל נוכחותם של תאים אבות סרטניים מובחנים יותר וצבירה עצמית, ידוע להתרחש בצפיפות תאים גבוהה23, אשר נחשב מגבלה של שיטה זו על ידי כמה. כדי להעדיף העשרה לתאי גזע מתחדשים לטווח ארוך, בניגוד רק אבות אשר יכול לגדול באופן חולף כמו נוירוספרות22, נוירוספרות העיקרי מנותקים להיווצרות נוירוספרה משנית, ומעבר נוסף עבור מינימום של 10 קטעים, שווה בערך 2 חודשים בתרבות רציפה, המהווה אינדיקציה של אוכלוסייה מועשרת בתאי גזע22. מניסיוננו, תרבויות נוירוספריות GBM המשיגות את הסימן הזה יכולות להמשיך להתרחב כמו נוירוספרות ללא הגבלת זמן. כיתה הגידול חשוב, שכן השגנו תרבויות מוצלחות מ GBMs ו astrocytomas אנאפלסטי, WHO כיתה IV ו- III, בהתאמה, אבל לא מ gliomas כיתה נמוכה יותר.
השיטה הנפוצה ביותר של culturing תאים גליובלסטומה, במדיום הצמיחה המסורתי בתוספת 10% FBS, מוביל הבדל גנומי ופנוטיפי ניכר מן הגידולים המקוריים 4. מצד שני, תרבויות נוירוספריות הן מקור יציב וארוך טווח של תאים המציגים פנוטיפ תא גזע סרטני4. השיטה neurosphere הפך פופולרי יותר ויותר עבור העשרה של CSC בתרבויות לטווח ארוך עבור מודלים קסנוגרפט עכבר אורתוטופי, למרות שלא היה מוצלח עבור כל דגימות אסטרוציטומה בדרגה גבוהה, המייצג את החולשה העיקרית של שיטה זו. מחקרים כדי להבין כיצד מאפיינים מולקולריים של גידולים הוריים יכולים להשפיע על היווצרות נוירוספרה נמצאים בעיצומה. חקירה של שיטות חלופיות מעשיות לתרבות gliomas כיתה גבוהה, ואחריו אימות נרחב מוענקים, בהתחשב ביתרונות חשובים של בעל מודלים GBM ספציפי החולה, כפי שאנו מתקדמים לעידן של רפואה מותאמת אישית, מונע על ידי הנגישות של מידע "omics" ומספר גדל של טיפולים ממוקדים פוטנציאליים.

גליובלסטומה (GBM), אסטרוציטומה בדרגה IV של ארגון המחשב העולמי, היא הגידול העיקרי הנפוץ והאגרסיבי ביותר במוח. פנוטיפים התפתחותיים מגוונים מאומצים על ידי תאים סרטניים GBM, כולל תאים המציגים "תא גזע סרטני" (CSC) מאפיינים, כגון הביטוי של תאי גזע עצביים (NSC) סמנים, התחדשות עצמית לטווח ארוך, ואת הפוטנציאל להוליד תאים מובחנים יותר להביע סמנים אסטרוציטיים ויוצרים את החלק הארי של הגידול1-3. בעוד הבהרה עדיין נדרשת לגבי זהות מולקולרית CSC והשלכות קליניות, המוקד של העבודה הנוכחית היא על ההגדרה התפעולית של CSC: התחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה ואת היכולת להבדיל ולשכפל את הגידול המקורי על השתלה אורתוטופית מכרסמים immunocompromised.
תאי גליובלסטומה כבר תרבית במשך עשרות שנים במדיום מסורתי המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) וכמה מעברים גבוהים זמינים מסחרית סרום קווי תאים GBM מתורבת הם tumorigenic במכרסמים immunocompromised, אבל יש הבדל גנומי ומולקולרי ניכר מן הגידול המקורי4, הגבלת השימוש בהם כמודלים רלוונטיים קלינית. לאחרונה, תאים עם פנוטיפ גזע / אב מגיב EGF ו bFGF זוהו GBMs2. לאחר מכן, דגימות גידול GBM מנותקות היו מתורבתות במדיום ללא סרום3, נוסחה במקור לבחירה והרחבת תאי גזע עצביים ממוחו של היונק הבוגר5. תנאי תרבות אלה לעכב את הצמיחה של רוב אוכלוסיות תאים סרטניים nonneoplastic ויותר מובחנים, תוך העדפת הצמיחה של תאי גזע ואביזרים כמו ספרואידים רב תאיים צפים, או נוירוספרות3, מחקה את ההתנהגות של תאי גזע עצביים יונקים בוגרים5. השוואה מקיפה זה לצד זה של תאי GBM ראשוניים בתרבית בינונית נוירוספרית בתוספת גורמי גדילה (NMGF) או במדיום הצמיחה המסורתי בתוספת 10% FBS, גילה כי neurospheres GBM היו tumorigenic, הציג פוטנציאל בידול רב לשוני, ושימר את הגנוטיפ של הגידול המקורי, בניגוד 10% תרבויות FBS אשר לא היו tumorigenic במעברים נמוכים במידה ניכרת סטה מן הגידולים המקוריים במעברים מאוחרים4.
בידוד של CSC מגידולים GBM מנותקים על ידי מיון תאים בהתבסס על הביטוי של סמן CSC putative CD133 הוצע גם 6,7, אבל עבודה נוספת הצביעה עלכךפנוטיפ CSC אינו קשור באופן סופי עם הביטוי של סמנים כאלה8-10, הפחתת ההתלהבות הראשונית עבור אסטרטגיה זו, ואילו סמנים חדשים עדיין נבדקים10. חוסר הזמינות עד כה של קבוצה מאומתת של סמנים המגדירים CSC, יחד עם המטרה של הגברה בקנה מידה גדול של תאים אלה למחקרים פרה-קוליניים, הופך את השימוש במיון תאים לבלתי מעשי עבור תרבויות שגרתיות המועשרות ב- CSC. תאי GBM שנבחרו על ידי היכולת לגדול כנוירוספרות ב- NMGF מבטאים תמיד סמני תאי גזע עצביים. ראינו כי Sox2 ו nestin באים לידי ביטוי בכל מקום בתרבויות נוירוספרה, בעוד חלבון CD133 קיים בקבוצת משנה של נוירוספרות GBM (נתונים שלא פורסמו התייחסות11).
מספר מעבדות רודפות אחר תרבויות נוירוספריות מגידולי גליובלסטומה באמצעות אותה גישה כללית של דיסוציאציה אנזימטית ופולחן במדיום ללא סרום בתוספת גורמיגדילה 3,4,11-14, בעוד עמיתים אחרים דיווחו על ניסיונות לגדל תרבויות נוירוספריות לטווח ארוך מדגימות GBM ללא הצלחה . השיטה הכללית לדיסוציאציה אנזימטית ותרבות נוירוספרית של גליומות בדרגה גבוהה המוצגות כאן דומה למה שתואר בפרסומים לעיל. אופטימיזציה של הפרוטוקול מבוסס על הניסיון שלנו של ניתוק ו culturing מעל 100 GBM דגימות. היעילות של קבלתתרבויותנוירוספריות לטווח ארוך מדגימות GBM טריות החלת הפרוטוקול המוצג כאן הוא מעל 40%, בדומה לדיווחים המעטים המראים נתוני יעילות 3,15, המוביל לחקירה של פרוטוקולים חלופיים כגון תאים culturing ללא הרף או לסירוגין במדיום ללא סרום בנוכחות EGF ו bFGF כמו monolayers על משטחים מצופים חלבון ECM16,17. תרבויות נוירוספרה הם עדיין הגישה המאומתת והפופולרית יותרויותרכדי לשמר גידולים GBM מאפיינים מולקולריים ופוטנציאל tumorigenic 3,4,11-14, ולכן הגישה שלנו היא לנסות תרבויות נוירוספרות הראשון, תוך בדיקה זמנית של שיטות חלופיות ליצירת תאי GBM שאינם מצליחים ליצור נוירוספרות מתחדשות-עצמית לטווח ארוך ( איור 1 ), כדי להגדיל את הייצוג של גידולים GBM שניתן להשתמש בהם במודלים של בעליחיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיכנות נוירוספרות מ- GBMs. עבור תאים שאינם מצליחים ליצור נוירוספרות, אנו מראים שינוי פשוט במדיום הצמיחה, כניסיון הראשון לתרבות תאים tumorigenic מן nonneurosphere להרכיב GBMs, עם תוצאות מבטיחות ועדיין עובר אימות נרחב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

Glioblastomas, הצורה הנפוצה והאגרסיבית ביותר של אסטרוציטומה, הם עקשן לטיפול, והטרוגני מולקולרית. היכולת להקים תרביות תאים המשמרות את הפרופיל הגנומי של גידולי ההורים, לשימוש במודלים ספציפיים למטופל במבחנה וב-vivo, יש פוטנציאל לחולל מהפכה בהתפתחות הפרה-קולינית של טיפולים חדשים לגלובלסטומה המותאמים למאפיינים המולקולריים של כל גידול.
החל מגידולי אסטרוציטומה טריים בדרגה גבוהה המנותקים לתאים בודדים, אנו משתמשים במדורה הנוירוספרית כשיטת העשרה לתאים המציגים פנוטיפ של תאי גזע סרטניים, כולל ביטוי של סמני תאי גזע עצביים, חידוש עצמי ארוך טווח במבחנה, והיכולת ליצור גידולים אורתוטופיים קסנוגרפט. שיטה זו הוצעה בעבר, וכעת היא נמצאת בשימוש על ידי מספר חוקרים. בהתבסס על הניסיון שלנו של ניתוק ו culturing 125 דגימות גליובלסטומה, הגענו לפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן, מתאים פולחן נוירוספרה שגרתית של astrocytomas בדרגה גבוהה והתרחבות בקנה מידה גדול של תאים tumorigenic למחקרים פרה-קוליניים. אנו מדווחים על היעילות של תרבויות מוצלחות לטווח ארוך באמצעות פרוטוקול זה ומציעים חלופות סבירות עבור culturing תאי גליובלסטומה מנותקים שאינם מצליחים לגדול כמו נוירוספרות. אנו גם מתארים בפירוט פרוטוקול לשימור הארכיטקטורה הנוירוספרית בתלת-ממד לאימונוהיסטוכימיה. תרביות תאים מועשרות ב- CSCs, המסוגלות ליצור מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט המשמרים את החתימות המולקולריות וההטרוגניות של GBMs, הופכות פופולריות יותר ויותר לחקר הביולוגיה של GBMs ולעיצוב משופר של בדיקות פרה-קוליניות של טיפולים פוטנציאליים.

יישמנו את הפרוטוקול שתואר לעיל כדי לנתק ולתרבות 125 דגימות גליובלסטומה כירורגיות טריות (איור 1),88 אובחנו לאחרונה ו -37 גידולים חוזרים ונשנים (טבלה 2), בהסכמת המטופל המאושר ותחת הנחיות מוסדיות. היעילות של הפרוטוקול להקמת תרביות נוירוספריות לטווח ארוך הייתה 41.6%, ודומה לגידולים שאובחנו לאחרונה וגידולים חוזרים ונשנים (טבלה 2). עבור דגימות GBM מסוימות, נוצרים נוירוספרות בימים הראשונים (איורים 1B ו- 1C), ואילו עבור אחרים נדרש זמן פולחן ארוך יותר (איורים 1D ו- 1E).
היעילות של היווצרות נוירוספרה לא הייתה תלויה אך ורק ברמת הנמק ברקמה, כפי שבאה לידי ביטוי בתוצאות של גידול שאובחן לאחרונה עם צפיפות תאים גבוהה (GBM1) וגידול חוזר ונמק (GBM2) המעובד על פי פרוטוקולים 1 ו -2, שניהם מניבים תרביות נוירוספריות (איור 2).
בדיקת הפוטנציאל tumorigenic של כל תרבות נוירוספרה בעכברים immunocompromised הוא האימות המכריע של גישה זו להעשרה של CSCs. באמצעות פרוטוקול דומה שתואר בעבר18, GBM1 ו GBM2 נוירוספרות הושתלו במוחם של עכברים immunocompromised, תחת הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים IACUC. גידולי קסנוגרפט מציגים מאפיינים מורפולוגיים של GBMs, כגון פלישה לפרנצ'ימה במוח ונמק (איור 2).
GBM3 נותק (איור 1A) ותרבית במדיום נוירוספרי(איורים 1D ו- 1E),וב- 2% FBS / NMGF (איורים 1D, 1G ו- 1H). תאים חד-שכבתיים בתרבית של 2% FBS/NMGF ותאי נוירוספרה שתורבתו ב- NMGF היו מנותקים ומספר זהה של תאים הושתלו בעכבר עירום, באותו הליך כמו באיור 2. לא נצפו הבדלים בהישרדות, בדינמיקה של גידולים או במורפולוגיה בין שתי שיטות התרבות המוקדמות (איורים 3A-C). מאפייני הגדילה של הגידול אינם משתנים עד למעבר האחרון שנבדק, P20 לנוירוספרות ו- P10 עבור 2% FBS/NMGF. בעוד סמני תאי גזע עצביים, כולל Sox2, הם downregulated ברוב תאי GBM העיקריים בתרבית 10% FBS 3,4,11, NMGF בתוספת 2% FBS מאפשר שימור של ביטוי Sox2 (איור 3D).
נוירוספרות עובדו על פי פרוטוקול 4, ומסומן עם H&E (איור 4A), נוגדן אנטי-Sox2, המציג לוקליזציה גרעינית (איור 4B),ונוגדן EGFR, לוקליזציה של קרום התא (איור 4C). פרוטוקול זה הוחל כדי לגשת לשינויים תלויי גירויים בביטוי של nestin, GFAP, ואת סמן התפשטות Ki6711.
שולחן 2. יעילות של הפקת תרבויות נוירוספרה לחידוש עצמי לטווח ארוך מ- GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>פתולוגיה</td>
			<td>(ש"ע)</td>
			<td>אחוז הדגימות המניבות נוירוספרות לחידוש עצמי לטווח ארוך (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליובלסטומה - לא מטופל, ניתוח ראשון</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליובלסטומה - חוזר</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>סך</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> איור 1. תרבית תאים מדגימות ניתוחיות גליובלסטומה טריות. גידולים טריים מנותקים אנזימטית לתאים בודדים. ממשק תאים גרעיניים מאזור הפרדת צפיפות מצופה לאחר מכן ב- NMGF. נוירוספרות מנותקות מצופות ב- NMGF, ובדרך כלל יום אחד לאחר הציפוי יש תאים מתים, פסולת, תאים בודדים מחוברים, ומדי פעם תאים מתחלקים בהשעיה (A). היווצרות נוירוספרה היא מהירה יותר במקרים מסוימים (B, C), ואיטית יותר עבור אחרים (D,E). כל הנוירוספרות מנותקות ומופצות ל-10 קטעים לפחות, 41.6% ג'יגה-בתים מניבים נוירוספרות לחידוש עצמי לטווח ארוך. תאים דיסוציאציה GBM קיימא שאינם מצליחים לגדול כמו נוירוספרות (F) ניתן להעביר לתנאי תרבות חלופיים, למשל 2% FBS / NMGF (G, H). בר (A), 100 מיקרומטר, חל על כל התמונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> איור 2. דור נוירוספרה קסנוגרפטים עכבר אורתוטופי מגידולים GBM. דגימת גידול המציגה צפיפות תאים גבוהה (GBM1) וגידול עם תוכן נמקי גבוה (GBM2) היו מנותקים ונוירוספרות בתרבית במשך 10 קטעים על פי פרוטוקולים 1 ו -2. עכברים Immunocompromised הושתלו עם 3 x 105 תאים נוירוספריים מנותקים והקריבו כאשר moribund. מוחות עכבר היו פורמלין קבוע פרפין מוטבע עבור H&E כתמים וזיהוי אימונוהיסטוכימיה של סמנים אנושיים, המיטוכונדריה האנושית (hMit) או המעמד העיקרי histocompatibility אני subunit HLA-A (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> איור 3. גידול דומה בעכברים מושתלים תוך אופן עם תאי GBM3 בתרבית כמו נוירוספרות ב NMGF או כמו monolayers ב 2% FBS / NMGF. (A) עקומות ההישרדות קפלן-מאייר עבור GBM3 בתרבית כמו נוירוספרות ב NMGF או monolayers ב 2%FBS / NMGF (שניהם מעבר <10) להראות שום הבדל בהישרדות (n = 10, p = 0.7174, מבחן דרגת יומן). (B) גידול גידול במעקב על ידי הדמיה bioluminescence חי (BLI) להראות שום הבדל משמעותי בדינמיקה גידול בין שתי הקבוצות. (C)מורפולוגיה גידול הוא נבדל עבור 4 GBM3 xenografts, 2 תרבותי NMGF ו 2 תרבותי 2% FBS / NMGF. כתם MHC-I כמתואר באיור 2. סולם, 600 מיקרומטר. (D)כתם מערבי המציג את ביטוי יצרנית תאי הגזע Sox2 נשמר ב 2% FBS / NMGF תרבויות המשמשות ליזום את הגידולים xenograft (A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> איור 4. ניתוח של ביטוי חלבון בחלקים נוירוספריים על ידי אימונוהיסטוכימיה. תרביות נוירוספרה היו פורמלין קבוע פרפין מוטבע כמתואר בנוהל 4, ומוכתם H&E (A), נוגדן אנטי Sox2 (B), ונוגדן אנטי EGFR (C). מצע DAB שימש להמחאה חזותית (B, C). בר, 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry at JoVE.com

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K Views.  Henry Ford Hospital. פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מי?...

Video: Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

שימוש במודל של בעלי חיים אלח דם להערכת טיפולים צמחים רומן

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

בתדירות גבוהה אולטראסאונד הדמיה של בלוטות לימפה עכבר צוואר הרחם

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור phenotyping ותרופות

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

מודלי כירורגי של Gastroesophageal Reflux עם עכברים

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

מודל כדי לדמות היפוקסיה משמעות קלינית בבני אדם

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...