המחברים מבקשים להודות יוסף LoTurco ודניס Selkoe לדיונים מועיל על הטכניקה הזו. המחברים מודים לתורמים של קרן הבריאות האמריקאית לסיוע, לתמיכה של מחקר זה.

הפרוטוקול הבסיסי של electroporation ברחם תוארה בפירוט במאמר אחר יופיטר ממעבדת Kriegstein 1, 2. טכניקה זו תוארה לראשונה במעבדה Osumi 3 ופרוטוקול שלנו מבוסס על אחד שפותח במעבדה LoTurco 4. אנו נספק סקירה כללית של פרוטוקול שלנו ב electroporation של עוברים ברחם חולדה, תוך התמקדות בפרטים החשובים ביותר, ואחריה תיאור של פרוטוקול שלנו, כי חל electroporation ברחם כדי לחקור את תפקוד הגן תולדה תהליך עצבי. 1. Electroporation ברחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מחטים DNA וטעינה הצעד הראשון שכן electroporations ברחם היא לתכנן את הניסוי כדי לקבוע מה-DNA בונה אתה רוצה להזריק. שיטה זו שימושית עבור שניהם misexpressing או דריסה הגנים של עניין. אם אתם מתכננים על גן misexpressing או overexpressing, הקפד להשתמש האמרגן כי הוא פעיל בתאי מבשר עצביים. אנו ממליצים על האמרגן CAGGS, אשר מורכב של האמרגן עוף ביתא אקטין ואת משפר CMV 5. מאז רק תת קבוצה קטנה של תאים transfected משתמש electroporation ברחם, חשוב לכלול קידוד פלסמיד חלבון פלואורסצנטי כגון GFP, כך שתוכל לעקוב אחר תאים אלה שהיו electroporated בהצלחה. עבור ה-GFP הקידוד פלסמיד, אנו ממליצים להכין את ה-DNA בריכוז של 0.5 מיקרוגרם לכל microliter. עבור בונה shRNA, מצאנו כי 0.5-1.0 מיקרוגרם לכל התוצאות μL ב יעיל להפיל של הגן העניין שלך. עבור overexpression או misexpression, אנו משתמשים בין 1.0 ו - 3.0 מיקרוגרם לכל microliter, תלוי בגודל של הגן לבין רמת ביטוי בניסוי קורא. DNAs מוכנים באמצעות ערכת רעלן פנימי ללא Qiagen הכנה, ואת מדולל 1 x PBS. אנו להזריק כ 0.5-1.0 μL לכל המוח העוברי, ולכן, עבור פסולת של בעלי חיים אנו מכינים 10 μL של תערובת DNA להזרקה. אנו מוסיפים 1 μL של גרין מהיר ל-DNA, כך שנוכל לבצע את ה-DNA מוזרק. משיכת מחטים הצורה הנכונה היא שלב קריטי. Walantus et al. משתמשת במערכת שונה לאספקת ה-DNA וכך מכין מחט שלהם הוא גם שלנו 1,2 אז שונה slighly. ההגדרות שבהן אתה משתמש כדי למשוך את המחטים שלך יהיה תלוי המותג של חולץ מחט שיש לך. אנו משתמשים במודל 750 מ דוד Kopf. ההגדרות אנו משתמשים הם: מחממים 1: 9.0, מחממים 2: 0, Soleniod: 0, גודל חוט 3.0 מ&quot;מ, הסמיכות מחמם: 3 מ&quot;מ, זמן: 10 שניות. משך פעם, חתכנו מחטים שלנו עם סכין גילוח בזווית של 45 מעלות ~ כך המרחק בין החלק הגדול ביותר של פתיחת לקצה הוא 11 מ&quot;מ. לאחר מכן אנו לטעון את ה-DNA מהקצה האחורי של המחט. לאחר מכן למלא את החלל שנותר המחט עם שמן תירס. עבור זריקה DNA, אנו משתמשים III Picospritzer. בהתאם שפוע המדויק כי הוא חתך את כל מחט, אנו קובעים את Picospritzer 4.0-6.0. אנו משתמשים דוושת הרגל כדי לספק את האוויר הדחוס כי גירשה את ה-DNA מן המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת בעלי חיים לניתוח אנו משתמשים הפתוגן ללא חולדות Sprague Dawley בלעדית עבור ניתוחים אלה. מעבדות אחרות כמה להשתמש בעכברים של גנוטיפים שונים גם כן. כאן אנו מתארים להראות פרוטוקול שלנו electroporation של E15 עוברי חולדה, אבל ברחם electroporation מבוצע באופן שגרתי אצל חולדות בגילאים E13 ו E18. בעוד electroporation בשלב מוקדם מטרות רבדים עמוקים של קליפת המוח, בשלב מאוחר יותר electroporations היעד שכבות שטחית יותר. בעלי חיים מקבלים מנה טרום ניתוחית של עצירות (0.05-0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לפני הניתוח מתחיל. ישנן אפשרויות רבות עבור הרדמה החי. Walantus et al. מנצל משאיפת isofuorane, בעוד אנו משתמשים באופן שגרתי בזריקה intraperitoneal של קטאמין (4-80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (50-10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) 1,2. קמצוץ הבוהן תמיד צריך להתבצע על מנת להבטיח כי בעלי החיים מורדמים מלא להגיב. בעלי חיים מוחזקים על משטח מחומם לאורך ההליך הכירורגי. הפרווה של בעל החיים הוא מגולח באזור החתך, ורחץ שלוש פעמים עם אתנול ואחריו שלוש פעמים עם יוד. מבצעים חתך בעור לרוחב רק קו האמצע, ואחריו חתך השריר. קרניים הרחם נחשפים בזהירות רבה. הם התגרו בעדינות מתוך חלל הגוף באמצעות קצות האצבעות. שמור עוברים hydrated עם PBS סטרילית בזמן שהם מחוץ לחלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקת DNA ו electroporation בעת ההפעלה הראשונה של ביצוע ניתוחים אלה, החלק הקשה ביותר הוא היכרות עם שבו אתה צריך להזריק את ה-DNA, כך שתוכל למלא את החדרים לרוחב, ו להתרגל כמה עמוק אתה להזריק המחט שלך כדי להכות את האזור הנכון. עוברים הם מניפולציה בעדינות עם קצות האצבעות שלך, כך שאתה יכול הזיהויify איפה הראש, ואם תסתכלו היטב תוכלו לראות את תפר קו האמצע. זה משמש כנקודת ציון כללי שניתן להשתמש בו כדי לקבוע היכן ממוקם לרוחב החדר. אנו מזריקים את הדנ&quot;א דרך דופן הרחם לתוך החדר לרוחב. אנו משתמשים footpedal לשלוט על זריקה של ה-DNA - פולסים מרובים של ה-DNA מבוצעות עד לרוחב החדר מתמלא הדנ&quot;א / תערובת צבע. לאחר מכן, אנו מקום ההנעה אלקטרודות משני צידי ראשו של העובר ושימוש אחר footpedal כדי לספק את הדופק על הראש של העובר. מיקום האלקטרודות הוא קריטי בקביעת באזור של קליפת המוח היא electroporated. מאז ה-DNA הוא מטען שלילי, ה-DNA ינועו לכיוון האלקטרודה החיובית כאשר הממונה הוא פיזר ברחבי המשוטים. בהתאם למיקום המדויק של האלקטרודות, תת שונים של תאים יהיו ממוקדות. אנו שגרתי במקום אלקטרודה חיובית ליד הגבי-המדיאלי עמדות ברחבי המוח הגדול. עם זאת, במעבדה הראו כי LoTurco יפה אם אתה במקום אלקטרודות יותר באזורים לרוחב הגחון של המוח הגדול ניתן למקד את התאים של קליפת המוח, striatal תאים הגבול ולהכות של הנחל קליפת המוח לרוחב 6. כל העובר יכול להיות electroporated, ושילובים שונים של מבנים DNA יכול לשמש כל העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפירת ו שלאחר הניתוח טיפול בעקבות electroporation של כל העוברים, קרניים הרחם מוחזרים בזהירות לחלל הגוף, הן את שכבת השריר ואת העור הם sutured. הטכניקה לכך היא המתוארים Walantus ואח&#39; 1,2. בעלי חיים מנוטרים באופן רציף עד שהם להתאושש מן ההרדמה, ואת עצירות כאבים (0.05-0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג) מנוהל כל 8-12 שעות. </li></ol> 2. Culturing Electroporated נוירונים קליפתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיק המוח electroporated ו לנתח באזור electroporated עבור vivo בניתוחים הבאים electroporation ברחם, בעלי חיים ניתן לקצור בכל נקודת זמן של 24 שעות בעקבות electroporation מוקדם לאחר הלידה ועד לבגרות. עם זאת, כאשר נוירונים culturing העיקרי שאנחנו קוצרים 24 שעות לאחר electroporation ב E16. בשלב זה, את העוברים electroporated מביעים רמות לגילוי של ה-GFP. בעלי חיים מורדמים באמצעות פחמן דו חמצני שאיפה עריפת ראש מהירה. עוברים הם גזור מתוך הרחם והושמו HBSS עם קטיונים divalent, שמירה על מסלול של אשר היו עוברים electroporated שבה פלסמידים DNA. זה קריטי להשתמש HBSS מסונן, צינורות סטרילית צלחות וכלי autoclaved לנתיחה. בקליפת המוח הם גזור החוצה קרומי המוח הסיר באמצעות מיקרוסקופ במנדף. הקורטקס אלה נצפו אז תחת מיקרוסקופ לנתח עם היכולת לחזות GFP. אזורים GFP החיובי של קליפת המוח מזוהים, ואנחנו ue זוג vanna מספריים לחתוך את האזורים GFP חיובית בקליפת המוח. יצירות אלה ממוקמים HBSS ללא קטיונים divalent בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissociating ו ציפוי נוירונים לאחר כל האזורים GFP חיוביים גזור, HBSS מוחלף טריפסין 0.25%, ו מודגרות ב 37 מעלות במשך 5 דקות. טריפסין מוסר, החליף עם התקשורת ציפוי (DMEM + 5% FBS + פן / סטרפטוקוקוס גלוטמין +), ו 5-7 פעמים triturated לנתק את התאים. כרכים להשתמש תלויה בכמות רקמת הנוכחי. תאים ניתק הם מצופה מכן על CC2 שקופיות קאמרית מצופה. עבור שתי שקופיות קאמרית, אנו צלחת 200,000-350,000 תאים לכל תא בנפח של 1.5 מ&quot;ל של התקשורת ציפוי. לאחר 4 שעות, התקשורת היא ציפוי aspirated והחליפו עם 1.5 מ&quot;ל התקשורת העצבית תרבות (Neurobasal מדיה + B27 + תוספת + glutamax gentamycin) לכל תא. </li></ol> 3. ניתוח תולדה תהליך עצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון ו immunostaining תרבויות כדי למדוד effecs לטווח קצר של מניפולציה גנטית של תאים אלה, שאנחנו קוצרים את הנוירונים העיקריים לאחר שלושה ימים במבחנה. אם הנוירונים העיקריים הם להיות מתורבת יותר עבור ניתוח נוסף, חצי התקשורת יש להחליף כל שלושה ימים. לתיקון תרבויות, אנו לשאוב את התקשורת בין התאים, ולתקן את הנוירונים paraformaldhyde 4% במשך 15 דקות. בעקבות קיבעון, תאים נשטפים פעמיים ב PBS ולשים אז הפתרון חוסם (נסיוב החמור 2% עם 0.1% Triton X-100 ב PBS) במשך שעה אחת. תאים מודגרת מכן במשך שעה 1 של נוגדן ראשוני. עבור ניתוחים תולדה של תהליך עצבי, אנו משתמשים אנטי בטא נוגדן tubululin לזהות נוירונים - בטא טובולין immunostaining II תוויות הגוף neruonal התא, דנדריטים ואקסונים. תאים נשטפים אז שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות, ולאחר מכן במשך שעה מודגרות 1 בעכבר Cy3 אנטי, ואחריו עוד שלושה שוטף PBS, counterstaining גרעינים עם DAPI ועל הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת neאורך urite תמונות של ה-GFP חיובית, בטא III נוירונים טובולין חיוביים נרכשים על Axioskop Zeiss עם מערכת MC100 מצלמה. מספר משתנים ניתן לבדוק תאים אלה GFP חיובי כולל אורך neurites כל, אורך neurite הארוך, הסתעפות של neurites, בגודל של תא סומה, וכו &#39;יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תולדה תהליך עצבי על להפיל או ביטוי יתר של הגנים הנוגעים neurodevelopment ו ניוון מוחיים, עם דגש על אורך תהליך עצבי. כדי למדוד תוצאה תהליכים עצביים, אנו משתמשים AxioVision LE 4.4 תוכנה (מ Zeiss). בתוך תוכנה זו, קיימת אפשרות לבחור את הכלי &quot;מתאר&quot;. באמצעות כלי זה, אתה יכול להשתמש בעכבר המחשב כדי לעקוב אחר משך כל תהליך עצבי. זה קריטי כדי להגדיר את המטרה שבה אתה משתמש על מנת לקבל מדד מדויק של neurites שלך. עבור ניתוחים אלו, אנחנו בדרך כלל להשתמש מטרה 20x. </li></ol> 4. נציג תוצאות מצאנו כי ספראג גודל Dawley פסולת נע בין 6 ל 14 עוברים. בדרך כלל אנחנו electroporate כל העוברים. כל העובר יכול להיות electroporated עם שילוב שונה של DNAs. עם זאת, אנו בדרך כלל electroporate לפחות ארבעה מוחות עם מצב דומה ובריכת אלה מוחות לפני dissociating ו ציפוי. מצאנו כי בשיטה זו כ -75% מוחות electroporated ממוקדות לאזור הרצוי של קליפת המוח, בין אם זה להיות הגבי הקורטקס המדיאלי או לרוחב הגחון (איור 1). בנוסף, מצאנו electroporations מוקדמת E13-14 עמוק היעד הנוירונים בשכבה כגון Tbr1 נוירונים שכבה VI חיובי, בעוד electroporations מאוחר היעד CTIP2 חיובי, שלילי TBR1 V שכבת תאים, ועדיין מאוחר יותר electroporations היעד Brn2 חיובי II / III שכבת התאים. תיאור מצוין של סמנים שונים ההסבר מפרט תת נוירונים בקליפת המוח נמצא בתוך מאמר של Moleneaux ואח&#39; 7. תרשים 2 מציג קטעים העטרה של המוח electroporated ביום או עובריים 15.5 או 17.5 וקצרו ביום הלידה 5. באדום הוא immunostaining עבור Oct6. אתה יכול immunostain עבור סמנים בתרבות כדי לאשר את מה שכבת אוכלוסיות תאים התמקדת. מצאנו כי אתה יכול לצפות היעד התא אותו שכבת אוכלוסיה של התאים בעובר בכל המלטה אותו (במילים אחרות, את המיקוד תלויה timepoint העוברי ולא לאחר מכן על וריאציות טכניים אחרים). בתרבות, אחוז התאים ה-GFP חיובית יכולה מגוון נרחב תלוי איך אתה שמרני כאשר מנתחים את אזור ה-GFP חיוביים (איור 3). עם זאת, גם כאשר אנחנו שמרנים מאוד לנתח רק את תיקון ה-GFP חיובית של תאים, האחוז הגבוה ביותר שאנו רואים הוא 5-10% - למרות שאתה לנתח את האזור של קליפת המוח אשר electroporated, התאים בשכבה אחת בלבד יהיה להיות ממוקד. זה effciency transfection נמוך מסייעת לזהות אילו תהליכים שייכים לתא electoporated שאתה ניתוח. תאים ציפוי בצפיפות גבוהה זה תורם שיש תרבויות heathier, לעומת זאת, קשה להבחין מה שייך תהליך שבו הגוף התא בתאי ה-GFP שלילי (איור 3). אם אתם מתקשים לראות את כל התהליכים קנס של תאים electroporated, אתה יכול גם להעלות את ריכוז ה-DNA-GFP שאתה electroporating להגדיל את הביטוי של ה-GFP, או שאתה יכול immunostain ניתק את התאים באמצעות נוגדן אנטי-GFP (מ Invitrogen ) יחד עם הנוגדן Cy2 משנית. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. E15.5 Sprague-Dawley חולדות electroporated עם GFP פלסמיד וקצרו כעבור שלושה ימים. בהתבסס על המיקום של האלקטרודות, באזורים שונים של קליפת המוח יהיו ממוקדות. AF להראות GFP הקרינה במוח כולו. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. E15.5 (א) או E17.5 (ב) Sprague-Dawley חולדות electroporated עם GFP פלסמיד וקציר ביום הלידה 5. המוח תוקנו, מחולק coronally באמצעות vibratome (100 סעיפים מיקרון), ו immunostained עבור Oct6 (אדום). A ו-B להראות תמונות confocal סעיפים immunostained. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. E15.5 Sprague-Dawley חולדות electroporated עם GFP פלסמיד. 24 שעות לאחר electroporation, המוח נקצרו GFP חיובי, אזורים electroporated נותחו ו ניתק, כפי שמתואר בסרט. אחרי 3 ימים במבחנה, התאים היו קבועים immunostained עבור טובולין-bIII (אדום) מכתים גרעינים עם DAPI (כחול) (A, C). אורכו של neurite הארוכה ביותר נמדדה בעזרת תוכנה AxioVision(ב, ד).

<ol>
	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במחקר במבחנה של תרבויות העצבית העיקרית לאפשר ניתוחים כמותיים של תולדה neurite. על מנת ללמוד כיצד משפיעים שינויים גנטיים תולדה תהליך עצבי, או בונה shRNA misexpression יכול להיות מוחדר דרך נוירונים העיקרי transfection כימיים או התמרה ויראלית. עם זאת, עם תאים בקליפת המוח העיקרי, בריכ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cortical Neuron Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14185-052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14065-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630-080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dishes and Vials:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>
</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-547-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-554-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Tools:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91402-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Forceps</td>
<td>
</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11273-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11255-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Miscellaneous:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hand-Held Tally Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z169021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plating Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Growth Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEUROBASAL Medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX -I Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin Reagent Solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunostaining:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fixative, Washes, and Blocking Buffer:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>017-000-121 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibodies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>beta-III tubulin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>MAB1637</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAP2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB15452</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy3 anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>715-166-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy2 anti-chicken</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>703-226-155 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>D3571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide Preparation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>154852</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48393-106 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72180</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>995-2949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>4015809TV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>1118217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTX square wave electroporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BTXECM830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450488</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

במחקר במבחנה של תרבויות העצבית העיקרי מאפשר ניתוחים כמותיים של תולדה neurite. על מנת ללמוד כיצד משפיעים שינויים גנטיים תולדה תהליך עצבי, או בונה shRNA cDNA יכול להיות מוחדר דרך נוירונים העיקרי transfection כימיים או התמרה ויראלית. עם זאת, עם תאים בקליפת המוח העיקרי, בריכת הטרוגנית של סוגי תאים (נוירונים glutamatergic משכבות שונות, נוירונים מעכבים, ותאי גלייה) הם transfected שימוש בשיטות אלה. השימוש ב electroporation ברחם להציג בונה DNA בקליפת מכרסם עובריים מאפשרת תת מסוימים של תאים להיות ממוקד: בעוד electroporation של עוברי מטרות שכבות מוקדם קליפת עמוק של קליפת המוח, electroporation ב timepoints עובריים מאוחר מטרות שכבות שטחית יותר. יתר על כן, מיקום ההפרש של אלקטרודות על פני ראשיהם של עוברי תוצאות בודדים המיקוד של אזורים הגבי-המדיאלי לעומת הגחון-רוחבי של קליפת המוח. בעקבות electroporation, תאים transfected יכול להיות גזור החוצה, ניתק, והוא מצופה במבחנה על ניתוח כמותי של תולדה neurite. כאן, אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד כדי למדוד כמותית תולדה תהליך תת העצבית של תאים בקליפת המוח. הפרוטוקול הבסיסי של electroporation ברחם תוארה בפירוט בשני מאמרים יופיטר אחרים מן המעבדה Kriegstein 1, 2. אנו נספק סקירה כללית של פרוטוקול שלנו ב electroporation ברחם, תוך התמקדות בפרטים החשובים ביותר, ואחריה תיאור של פרוטוקול שלנו, כי חל electroporation ברחם כדי לחקור את תפקוד הגן תולדה תהליך עצבי.

Watch this Scientific Journal Video about In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons at JoVE.com

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.6K Views.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי ג?...

Video: In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...