עבודה זו נתמכה על מענקים מNINDS (NS066071) וNIAAA. (P50AA017823) לECO. המחברים מודים לד&quot;ר רוברט קווין וצוות במחלקת המשאבים חיו מעבדה לטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ג&#39;דסון למונט לתמיכה טכנית, ניקול Belletier לסיוע כעמיתת מחקר לתואר ראשון קיץ (SURF). אנו מודים גם לד&quot;ר דיוויד קמרון להערות ועריכות בגרסה קודמת של כתב היד.

1. Electroporations רחם אקס עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרוני הזרקת DNA פלסמיד שהוכנו CAG-27-DNA eGFP המדולל לריכוז העבודה הסופי של 0.33 מ&quot;ג / מ&quot;ל בDDH 2 O. -Preps מקסי Endo-חינם Qiagen משמש כדי לטהר פלסמיד מחיידקים מותמרים. צבע ירוק מהיר ב~ 0.02% (w / v סופי) הוא הוסיף לתמיסת ה-DNA כנותב הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את אזור הניתוח, התיז על גבי ספסל ובמת מיקרוסקופ לנתח עם 70% אתנול ופתרון נגב יבש. רסס מספריים ומלקחיים כירורגית עם אתנול 70% לפני הנתיחה ולנגב יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכרי מתוזמן הריון שויצרי / ובסטר מוקרבים על E13 על ידי העביר לחדר מלא בCO 2 מצילינדר לחץ והסכר הוא פיקוח עד שכל התנועה שעצרה לדקות לפחות 1. לאחר קורבן על ידי 2 משאיפת CO העוברים יוסרו מן הרחם והניחו ב10 פתרון סנטימטר צלחת הפטר שהכיל קרח קר הנקס מאוזן מלוח (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח כל עובר מהקרומים המקיפים extraembryonic ולשמור בHBSS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל עובר באופן פרטני למנה שנייה 10 סנטימטרי פטרי המכילה HBSS הקר. השתמש במזרק המילטון להזריק 2-3 μl של התערובת הירוקה DNA המהירה לתוך את החדר של האונה השמאלית של המוח, טיפול להזריק באזור מרחב נפרד מאזור קליפת המוח לקליפת מוח ניתוח בעתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לelectroporate, להחזיק את העובר בעדינות בעזרת מלקחיים וקלים למקם את ההנעה החיובית של האלקטרודה פינצטה על קו האמצע הגבה של הראש וקל למקם את ההנעה השלילית מתחת לסנטר העובר. Electroporations מושגות עם BTX830 electroporator המתוכנת לספק 5 30 פולסים V של 50 אלפיות משך, מופרדים על ידי מרווחי 950 msec. הגדרות אלה הן לBTX830 המודל. מערכות אחרות ניתן להשתמש על פי instructio של היצרןns. </li></ol> 2. הכנת Explant חצי כדור שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation העוברים מוצבים בחזרה לHBSS קר כקרח. המוח מוסר באמצעות שני # 5 מלקחי תכשיטים להסיר את העור וגולגולת סחוסים מראש העובר. מלקחיים אז הוא החליק מתחת למוח כדי להסיר את המוח ללא פגע מהגולגולת. אונת electroporated (משמאל) לאחר מכן גזורה מרקמת המוח ובמצורפת אמצע המוח הוסרה. במהלך טיפול הליך הנתיחה נלקח לא לפגוע בקרומי המוח מונחים על האונה השמאלית של קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנתח את כל עובר מועבר בHBSS באמצעות pipettor עם קצה חיתוך 1 מיליליטר פיפטה. האונה מסולקת בעדינות על גבי עלון תרבות קולגן מצופה. עד שישה explants אונה מסודרים צד המדיאלי על כל עלון מ&quot;מ 24. HBSS לאחר ארגון העודף יוסר מלהוסיף ולאחר מכן להוסיף ממוקם לתוך 1 35 מ&quot;מ גם של מנה גם 6. גם מכיל Exactly 2.7 מ&quot;ל של תקשורת: תקשורת DMEM-F12 המכיל Glutamax והשלים עם 2% B-27, 1% G5 ו 1% פניצילין-דלקת. כמה טיפין של תקשורת מהיטב ניתן pipetted על גבי זה explant, אבל לא להוסיף מדיה בעודף של 2.7 מ&quot;ל המקורי לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר explants הוצב על גבי מסנני קולגן המנה גם 6 המכילה את explants ממוקמת לתוך Billups רוטנברג (BR) קאמרי (שמכיל גם מנת humidifying של מים). תערובת של 95% חמצן / 5% / CO 2 גז הוא החדיר לתוך התא לדקות לפחות 1 לפני האיטום סוגר הקאמרי וניתוק צינור אספקת הגז 2 95% החמצן / 5% / CO. BR הקאמרי הועבר אז ל37 מעלות צלזיוס רקמות תרבות חממה ליתרת תקופת התרבות, 1-2 DIV. </li></ol> 3. קיבוע של רקמות Explant ליסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף להכין פתרון קיבעון פגאנו ידי g 8 solubilizing הראשון של paraformaldehyde ב100 מ&quot;ל של שחוממה מראש (~ 80 &amp; דהז; C) DDH 2 O. הוסף 1-3 טיפין המרוכזות NaOH לקדם solubilization ועדינות מערבבת. ברגע solubilized לערבב 8% פתרון paraformaldehyde 01:01 עם פתרון זה הוא סוכרוז 500 מ&quot;מ, 100 המ&quot;מ Hepes, 7.4 pH, 50 המ&quot;מ MgCl 2, KCl mM 5 לריכוז סופי של paraformaldehyde 4% ב -250 50 המ&quot;מ Hepes סוכרוז המ&quot;מ , 25 המ&quot;מ MgCl 2, 2.5 mM KCl, 7.4 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את explants לחמם את פתרון תיקון פגאנו עד 37 ° C. סר במהירות מרבית DMEM/F12 מדיה מכל תרבות היטב ומוסיף 5 מ&quot;ל של תקן פגאנו לכל באר של explants. הקפד לכסות את כל explant לחלוטין בתיקון. תקן עבור שעה 1 בRT. אל תסיר explants ממסנן לפני 1 השעה של קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקיבוע להסיר את פתרון תיקון פגאנו ולהחליף עם פתרון פגאנו בלי מנה (250 מ&quot;מ 50 Hepes סוכרוז מ&quot;מ, 25 המ&quot;מ MgCl 2, 2.5 המ&quot;מ KCl, 7.4 pH). הוסף כמה טיפין של 10% יזידו הנתרן וחנות ב 4 ° C עד הטבעה. </li></ol> 4. הטבעה וSectioning ליסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% פתרון ג&#39;לטין עור עגל בsolubilizing 10 גרם ג&#39;לטין בעור העגל 100 מיליליטר מים חמימים (55-60 מעלות צלזיוס). הנח פתרון ג&#39;לטין על פלטה להגדיר עד 60 ° C ומערבולת מעת לעת עד solubilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק כ 10 מ&quot;ל של תמיסת הג&#39;לטין 10% לתחתית צלחת פטרי 10 סנטימטרים ומאפשרים 30 דקות כדי לחזק. זה יהיה בצורה &quot;כרית&quot; להטבעה את explants. רפידות אלו יכולות להיות ימים שהוכנו מראש ומאוחסנות ב 4 ° C. השתמש בסרגל כדי לצייר רשת בתחתית צלחת הפטר ולהעביר explants הבודד לתוך כל תיבה של הרשת. הסר פתרון פגאנו שיורים והשימוש pipettor, לכסות כל explant עם פתרון ג&#39;לטין חם 10% ולאפשר לביסוס. בנוסף לחדש איטי של פתרון ג&#39;לטין עד שכל explant מוקף לחלוטין על ידי ג&#39;לטין, נזהר שלא להמס את המשטח על ידי התוספת של מדי לחמם ג&#39;לטין מדי בבת אחת. לאפשר לג&#39;לטין להקשיח ל~ 1 שעה. ברגע שהקשיח individexplants רע&quot;מ אפשר לחתוך בלוקים קטנים של ג&#39;לטין. את הלוקים לפרסם-קבועים אז בפגאנו לתקן עבור 24-48 שעות לפני החתך עם vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants בלוקי ג&#39;לטין מוצב נורת חוש ריח ונותח במטוס העטרה בעובי מיקרומטר 100. הסעיפים נאספים ונשמרים בPBS + 0.1% יזידו הנתרן ב 4 ° C עד עיבוד immunohistochemical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור immunohistochemical מתבצע על ידי העברת חלקים לצלחת גם 24 (2-3 חלקים לטובים). נוגדן הבלוק הראשון הלא ספציפי מחייב על ידי הוספת 0.5 המ&quot;ל PBST + B (PBS 0.5% + טריטון X 100 ו 2% BSA) לכל באר, שעות לדגור 1 עם טלטול עדין. אז הנוגדן הראשוני המתאים דילול בPBST + B ו -0.4 מ&quot;ל לגם הוא הוסיף לדגירת הלילה בRT. העיקרי הוא שטף החוצה עם 3X PBS שוטף לפחות 10 דקות כל אחד. הנוגדן המשני ו2 מיקרוגרם / המ&quot;ל Hoechst 33342 גרעיניים כתם לאחר מכן, בדילול PBST + B והדגימות מודגרת עבור 2 שעות בRTעם טלטול עדין. שלוש כביסות PBS (10 דקות כל אחד) ולאחר מכן מבוצעות הסעיפים הם רכובים על שקופיות באמצעות 90% גליצרול 50 mM טריס, pH7.4, תקשורת גוברת. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו שיפור ומוערך מודל ניסויי - explants אונה השלמה - למחקר על התפתחות קליפת מוח המוקדמת (E13-E15). המודל הוכיח שימושי לניתוח של הגירה ובידול של שושלת נוירון המעוררת שמהווה שכבה 6 של קליפת מוח 25,37. יתרונותיה העיקריים של המערכת הם: 1) צמיחת organotypic ל2 DIV, 2) פשטות של הכנה, ו3) גי...

צורות יונקי קליפת המוח באמצעות התפשטות, ההגירה ובידול המרוכז של נוירונים שנוצרו ברציפות. כל נוירון הוא נולד באזור חדרית (VZ) ונודד מVZ לאיזור ביניים (א.ת.), ויצר את צלחת קליפת המוח (CP) 1. כשהם עוברים דרך תחומים שונים של קליפת מוח, תאי העצב הנודד יציג את המצבים מרובים של הגירת 2,3 התלויים בסביבה התאית ומרכיבים תאיים אחרים (למשל גליה רדיאלי) בתוך הרקמה המתפתחת. נוירונים בקליפת מוח ואז לעצור את ההגירה בראש צלחת קליפת המוח להרכיב בתהליכים החופפים מעצר הגירה ועצבי 4 dendritogenesis. התפתחות קליפת המוח היא שיזם בין ימים עובריים 11-13 (E11-13) 5 עד הקמתה של השכבה הקדמונית plexiform 6 או preplate (PP), שכבה של תאי עצב חלוץ שoverlies VZ. לעתידשכבת 6 נוירונים בקליפת מוח (כלומר נוירונים בקליפת המוח הראשונים שנולדו בVZ) ואז לכוון אותם בsomata דפוס סטריאוטיפי ולהתגבש לשכבה ברורה בתוך 7 PP. אירועים אלה לפצל preplate ל( שכבת עתיד קורטיקלי 1) שטחית שולית ואזור עמוק, שהאחרון המורכב של תאי קליפת המוח (שכבת subplate חולפת 7). תהליך זה, המכונה פיצול preplate, הוא אירוע מכונן בצמיחה העתידית של קליפת מוח 8. מוטציות גנטיות רבות זוהו לשבש היבטים שונים של התפתחות קליפת המוח 9. התפתחות קליפת המוח יכולה גם להיות מושפעת לרעה על ידי חשיפה לרעלי ingested כמו קוק 10 ו 11 באלכוהול. בגלל מומים בקליפת המוח שמתעוררים במהלך פיתוח הם תורמים צפויים הפרעות נוירולוגיות (למשל אוטיזם, סכיזופרניה), חקירות אמפיריות של הפרעות להתפתחות קליפת מוח טבועותly החשוב. לכן חשיבות רבה להקמת גישות ללמוד פיתוח קליפת המוח שייאפשרו מבחנים מהירים של השפעות גנטיות או רעל אבל זה גם לשמור על אינטראקציות האפשריות בין הנוירונים מבדילים, סוגי תאים אחרים ומטריקס (ECM) בתקופה המוקדמת של התפתחות המוח 12 . explants Slice 13 ספק מערכת כזו והיה בשימוש נרחב לפיתוח נוירון קורטיקלי assay 14-16. עם זאת, מבחנים פרוסים יכולים לסבול מהחסרון שההגירה ולמינציה עצבית יכולים להיות נורמלית 17 אולי בשל ניזק לתאי meningeal המקיפים את המוח ועוגן פיתוח רדיאלי גליה פיגום. כסיבי גליה רדיאליים הם מצע חשוב ל18 שיבוש הגירת נוירון קורטיקלי של lamina הבסיס של חיתוך עלול לשבש באופן מקומי ארכיטקטורת גלייה רדיאלי ולהוביל להגירת קליפת מוח שונה. בנוסף SLIמשטחי CED של explants מספקים אזור של תאים מתים שעשוי לשנות את ההרכב הרגיל של ECM באזורים אלה. גישות מאוחרות יותר התמקדו הניתוח שלהם בתאים הנמצאים עמוק בפרוסה שמוקפות בסוגים מתאימים בריאים סלולריים וECM. עם זאת, במקרים מסוימים גם גישות חדשות אלו יכולות לדרוש שהפרוסה העבה התרבותית המקורית להיות cryo-נותחה או פרפין נותח לאחר קיבוע כך שהחלק הפנימי הנורמלי יחסית של הפרוסה נעשתה זמין לניתוח 19-21. שניהם vibratome המקורי חתך להכין את הפרוסות החיות לתרבות כמו גם cryosectioning הבא של פרוסות קבועות לניתוח דורש טיפול ומאמץ למבחנים אלה לעבודה. כדי לספק גישה פשוטה, ללימודים משלימה של התפתחות קליפת מוח מוקדם, יש לנו גישות שונות an פרוס קיימות 13 כדי להקל על מחקרים של התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם. פתחנו WHמודל ole אונת explant דומה למודל קיים E14 כל אונה שמעורבות תרבויות רועדות ב 65 סיבובים לדקה וצמיחת organotypic מותר ל16-18 שעות 22,23. בגישה שלנו, explants אונה השלמה מונחים על קרום חדיר למחצה עם 13 באווירת תרבות חמצן גבוהה 21,24 להאריך צמיחת קליפת המוח organotypic עבור 48 שעות. גישה זו גם מאפשרת לelectroporation העקבי של פיתוח נוירונים בקליפת המוח. העוברים יוסרו מהרחם וelectroporated להציג את ה-DNA פלסמיד ולאחר מכן telencephalon מנותח. אונה כל מבודדת והניחה את הצד המדיאלי על מסנן קולגן מצופה. אז explant בתרבית לתקופה של 48 שעות, תקופה שכוללת פיצול preplate 8. בתקופת התרבות, L6 הנוירונים להתפתח ממבשרים 25 נוירון המובחן, ממוקם כראוי בתוך צלחת קליפת המוח. בכל תקופה זו מתפתחתנוירון מוקף ECM המתאים וסוגי תאים שיעמידו התא המתאים בגוף חי. שיטה זו כבר הוכיחה יקרה בפענוח האירועים התאיים העומדים בבסיס רעילות אתנול 26, 6 והיווצרות שכבת preplate פיצול 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

התפתחות קליפת מוח כרוך אינטראקציות מורכבות בין תאי עצב ואלמנטים שאינם עצביים בין תאים מבשרים, כלי דם, קרום מוח ומטריקס המשויך. משום שהם מספקים סביבה מתאימה organotypic, explants הפרוס קליפת המוח משמשים לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות אלה ששולטים בהתמיינות והתפתחות עצביות. אמנם מועיל, מודל explant פרוסה יכול לסבול מחסרונות כוללים למינציה סלולרית חריגות והגירה. כאן אנו מדווחים מערכת כל חץ כדור מוחית explant ללימודים של התפתחות קליפת המוח הקדומה שיותר קל להכין מפרוסות ומופעי קליפת מוח הגירת organotypic עקבית ולמינציה. במערכת מודל זה, למינציה המוקדמת ודפוסי נדידה להמשיך כרגיל לתקופה של ימים במבחנה, לרבות תקופת פיצול preplate, במהלך ששכבת קליפת מוח פוטנציאלית שש צורות. אז פתחנו electroporation הרחם לשעבר (EUEP)גישה שמשיגה הצלחה ~ 80% במיקוד הביטוי של GFP לנוירונים בקליפת המוח המתפתחים המדיאלי הגבה. כל מודל explant האונה עושה פיתוח נגיש עבור electroporation התערבות, תרופתית וגישות הדמיה חיות מוקדם קליפת המוח. שיטה זו מונעת ניתוח ההישרדות הנדרשת ברחם electroporation (IUEP) גישות תוך השיפור גם transfection ועקביות מיקוד Areal. שיטה זו תאפשר מחקרים ניסיוניים של שגשוג, נדידה והתמיינות של תאי עצב.

המכרסם העוברית הקליפה מציגה שיפוע neurogenetic רוחבי לאורך כל תקופת ההתפתחות, שהניאוקורטקס כגון רוחב הוא יום כ 1 בוגר יותר מ 28 הניאוקורטקס המדיאלי הגבה. חלק הארי של שכבה 6 הנוירונים נוצרים כך (כלומר, תציג S-השלב הסופי שלהם) על E12 בקליפת מוח לרוחב (המכונה גם שדה 40 5)...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר הכולל<em&gt; לשעבר רחם</em&gt; Electroporation, נתיחה והתרבות של אונות מוח שלמות מהעכבר העוברי. ההכנה מאפשרת לימודים ומבחנים פרמקולוגיים של תפקוד גן במהלך התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם.

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K Views.  SUNY Upstate Medical University. פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר הכולל לשעבר רחם Electroporation, נתיחה והתרבות של אונות מוח שלמות מהעכבר העוברי. ההכנה מאפשרת לימודים ומבחנים פרמקולוגיים של תפקוד גן במהלך התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם.

Video: Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...