저자는이 기술에 대한 유용한 토론 요셉 LoTurco과 데니스 Selkoe 감사하고 싶습니다. 저자는이 연구의 지원, 미국의 건강 보조 재단의 기부자 감사합니다.

utero의 electroporation에 대한 기본적인 프로토콜은 Kriegstein 연구실 1, 2에서 다른 조브 문서에서 자세히 설명되었습니다. 이 기법은 원래 오스미 연구실 3 설명한 및 프로토콜 LoTurco 실험실 4 개발 하나를 발견을 기반으로합니다. 우리의 연결 프로세스 가지의 유전자 기능 연구에 utero의 electroporation에 적용되는 우리의 프로토콜에 대한 설명 다음에 가장 중요한 세부 사항에 초점을 쥐 배아의 utero의 electroporation에 대한 우리의 프로토콜의 개요를, 제공할 것입니다. 1. utero의 Electroporation에 <ol><li> DNA와 로딩 바늘을 준비 utero의 electroporations에 대한 첫 번째 단계는 DNA가 당신이 주입하려는 구조 결정 실험을 디자인하는 것입니다. 이 방법은 misexpressing 또는 관심 유전자를 쓰러뜨린 모두 유용합니다. 이 misexpressing 또는 overexpressing 유전자에 계획하는 경우의 연결을 전구체 세포 활성 프로 모터를 사용해야합니다. 우리는 닭고기 베타 굴지의 모터와 CMV 향상제 5 구성되어 CAGGS의 발기인을 권장합니다. 세포의 단지 작은 하위 집합이 utero의 electroporation에 사용 transfected 있기 때문에 당신이 성공적으로 electroporated되었습니다 그 세포를 추적할 수 있도록, 그것은 같은 GFP로 플라스미드 인코딩 형광 단백질을 포함하는 것이 중요합니다. 플라스미드 인코딩 GFP 위해, 우리는 microliter 당 0.5 μg의 농도에서 DNA를 준비하는 것이 좋습니다. shRNA의 구성을 위해서는 효율에 μL 결과 당 0.5-1.0 μG 관심의 유전자의 허물고 것으로 나타났습니다. overexpression 또는 misexpression 위해, 우리는 유전자의 크기와 실험이 요구되는 표현의 수준에 따라 1.0 microliter 당 3.0 μG 사이에 사용합니다. DNAs은 Qiagen 내독소없는 준비 키트를 사용 준비, 1 X PBS에 희석하고 있습니다. 우리는 사출을위한 DNA 혼합물의 10 μL를 준비 동물의 쓰레기에 대해, 그래서 배아 두뇌 당 약 0.5-1.0 μL를 주입. 우리가 주입된 DNA를 수행 할 수 있도록 우리는 DNA와 빠른 그린 1 μL를 추가합니다. 올바른 모양 바늘을 당기는 것은 중요한 단계입니다. Walantus 외가. DNA를 전달하기위한 다른 시스템을 사용하고 있으므로 자신의 바늘 준비도 slighly 다른 그러면 우리 1,2입니다. 당신의 바늘을 끌어하는 데 사용하는 설정을 가진 바늘 풀러의 브랜드에 따라 달라집니다. 우리는 데이비드 Kopf의 모델 750을 사용합니다. 우리가 사용하는 설정은 다음과 같습니다 열 1 : 9.0, 열 2 : 0, Soleniod : 0, 필라멘트 크기 3.0 mm, 히터 근접 : 3mm, 시간 : 10 초. 일단 뽑아, 우리는 팁에 대한 개방의 가장 핵심적인 부분에서 거리는 11mm입니다 예 ~ 45도 각도에서 면도날과 함께 바늘을 잘라. 우리는 다음 바늘의 백 엔드에서 DNA를로드합니다. 그러면 옥수수 기름으로 주사 바늘에 남아있는 공간을 채우십시오. DNA의 주입을 위해, 우리는 Picospritzer III를 사용합니다. 각 바늘 절단 정확한 베벨에 따라, 우리는 4.0에서 6.0 Picospritzer을 설정합니다. 우리는 바늘의 DNA 퇴학 가압 공기를 제공하기 위해 발 페달을 사용합니다. </li><li> 수술 동물을 준비 우리는이 수술 전용 병원체가없는 스프 라그 돌리 쥐를 사용합니다. 여러 다른 연구소들도 genotypes 변화의 생쥐를 사용합니다. 여기, 우리는 E15 쥐 배아의 electroporation을위한 프로토콜을 보여주 설명하지만, utero의 electroporation은 일상적 E13와 E18 세 사이의 쥐에서 수행됩니다. 초기 단계의 electroporation은 피질의 깊은 계층을 대상으로하지만, 나중에 무대 electroporations 더 표면 레이어를 타겟팅할 수 있습니다. 수술이 시작되기 전에 동물 buprenorphine (0.05-0.1 MG / kg)의 사전 수술 약을 주어집니다. 동물을 anesthetizing위한 여러 옵션이 있습니다. 우리가 일상적으로 마취제 (40-80 MG / kg)과 xylazine (MG / kg 5-10) 1,2의 intraperitoneal 주사를 사용하는 동안 Walantus 외가., isofuorane 흡입을 활용합니다. 발가락 핀치는 항상 동물이 완전히 anesthetized 및 응답되는 것을 보장하기 위해 수행되어야합니다. 동물은 수술을 통해 온수 패드에 보관됩니다. 동물의 모피는 절개의 지역에 면도하고, 요오드와 세 번 다음 에탄올로 세 번 씻어입니다. 절개는 근육의 절개 다음, 정중선 단 측면 피부에 이루어집니다. 자궁 뿔은 매우 신중하게 노출됩니다. 그들은 부드럽게 귀하의 손끝을 사용하여 뱃속에서 조롱하고 있습니다. 그들이 밖 뱃속의하는 동안 멸균 PBS와 배아는 수산화 유지. </li><li> 주입 DNA와 electroporation 먼저이 수술을 시작할 때, 가장 어려운 부분은 측면 심실을 채울 수 있도록 당신이 DNA를 주입을 필요로하는 곳에 익숙한지고, 그리고 정확한 지역을 공격하기 위해 바늘을 얼마나 깊이를 삽입하는 데 사용지고. 당신은 답하라 수 있도록 태아도 부드럽게 손끝과 조작머리가 어디 쓸어하고 당신이 자세히 본다면 당신은 정중선 봉합을 볼 수있을 것입니다. 이것은 측면 뇌실의 위치를​​ 결정하는 데 사용할 수있는 일반적인 랜드마크 역할을합니다. 우리는 자궁 벽을 통해 측면 뇌실에 DNA를 주입. 측면 뇌실이 DNA / 염료 혼합물로 가득 때까지 DNA의 여러 펄스가 수행됩니다 - 우리는 DNA의 주입을 제어하는​​ footpedal을 사용합니다. 우리는 다음 배아의 머리 양쪽에 패들 전극을 배치하고 배아의 머리를 통해 펄스를 제공하는 다른 footpedal를 사용합니다. 전극의 위치는 electroporated입니다 피질의 어느 지역 결정 중요합니다. DNA가 부정 청구 있기 때문에, DNA는 요금이 충격기를 통해 무너 뜨 리신있는 긍정적인 전극쪽으로 여행을합니다. 전극의 정확한 위치에 따라 세포의 다른 하위 집합이 타겟이 될 것입니다. 우리는 뇌를 통해 지느러미 - 중간 위치 근처에 긍정적인 전극을 일상적으로 놓으십시오. 그러나, LoTurco 실험실 아름답게 당신이 뇌를보다 복부 측면 지역에 전극을 배치하면 당신은 측면 피질 스트림 6 피질 - striatal 경계를 누르십 세포의 세포를 대상으로 수 것으로 나타났다. 각각의 배아는 electroporated 수 있으며, DNA 구조의 다른 조합은 각 배아에서 사용할 수 있습니다. </li><li> Suturing 후 수술 치료 모든 배아의 electroporation에 따라, 자궁 뿔을는 신중하게 뱃속에 반환되며, 근육 계층과 피부 모두 봉합하고 있습니다. 이에 대한 기술은 Walantus 외 1,2에 설명되어 있습니다. 그들은 마취에서 회복까지 동물은 지속적으로 모니터링되며, 진통 buprenorphine (0.05-0.1 MG / kg)은 모든 8~12시간을 관리합니다. </li></ol> 2. Culturing 대뇌 피질의 뉴런을 Electroporated <ol><li> electroporated 머리를 수확하고 electroporated 지역 해부 utero의 electroporation에 다음과 같은 생체내 분석의 경우, 동물은 성체로 출생 후 초기에 electroporation 다음 24시간에서 언제 시점에서 수확한 수 있습니다. 그러나, 언제 culturing 기본 뉴런 우리는 E16에 electroporation 다음 24 시간 수확. 이때 electroporated 배아는 GFP의 감지 수준을 표현하고 있습니다. 동물은 이산화탄소 흡입 및 신속한 잘린을 사용하여 euthanized 있습니다. 태아는 자궁 밖으로 해부와 이가의 양이온과 HBSS에 배치, 태아가 어떤의 DNA plasmids과 electroporated되었습니다 추​​적하는 유지하고 있습니다. 그것은 필터링 HBSS, 무균 튜브 및 접시, 그리고 해부에 대한 autoclaved 도구를 사용하는 것이 중요합니다. cortices는 밖으로 해부하고 meninges는 모자에 현미경을 사용하여 제거됩니다. 이러한 cortices 그런 다음 GFP를 시각화하는 능력과 해부 현미경으로 관찰됩니다. 피질의 GFP 긍정적인 영역은 확인하고, 우리는 도대체 피질에서 GFP 긍정적인 영역을 잘라 바나 가위입니다. 이 작품은 15 ML 원뿔 관에 이가의 양이온없이 HBSS에 배치됩니다. </li><li> 뉴런을 Dissociating 및 도금 모든 GFP 긍정적인 지역을 해부되면, HBSS는 0.25 %의 트립신으로 교체하고, 5 분 37도에서 incubated입니다. 트립신은 삭제 도금 미디어 (DMEM + 5% FBS + 펜 / strep + 글루타민), 그리고 세포 분열시키다하는 triturated 5-7 시간으로 바뀝니다. 볼륨 조직 현재의 양을 따라 달라집니다를 사용합니다. Dissociated 전지는 다음 CC2 코팅 챔버 슬라이드에 도금입니다. 도금 미디어 1.5 ML의 볼륨을 두 개의 챔버 슬라이드 위해, 우리는 플레이트 챔버 당 200,000-350,000 세포를. 사시간 후, 도금 미디어 aspirated이며 챔버 당 1.5 ML의 연결을 문화 미디어 (Neurobasal 미디어 + B27 보충 + glutamax + gentamycin)로 교체. </li></ol> 3. 의 연결 프로세스 가지 분석 <ol><li> 문화를 고정하고 immunostaining 이러한 세포의 유전자 조작의 단기 effecs를 측정하기 위해, 우리는 체외에서 사흘 뒤에 기본 뉴런을 수확. 기본 뉴런 추가 분석을 위해 더 이상 양식 수있다면, 미디어의 절반 세 일마다 교체해야합니다. 문화 고정을 위해, 우리는 실에서 미디어를 대기음, 15 분 4 % paraformaldhyde에있는 뉴런을 수정. 다음 고정은 세포는 PBS로 두 번 씻어 후 차단 용액 (2 %의 당나귀 혈청 0.1 % 트리톤 PBS에서 X - 100) 1 시간.에 배치되어있는 전지는 다음 1 시간 동안 일차 항체에 incubated 수 있습니다. 의 연결 프로세스 가지의 분석을 위해, 우리는 뉴런을 식별하는 안티 - 베타 tubululin 항체를 사용하여 - 베타 II의 tubulin의 immunostaining은 neruonal 세포 기관, dendrites과 axons을 표시합니다. 전지는 다음 5 분 동안 PBS로 세 번 씻어 다음 DAPI로 핵 counterstaining 및 장착 세 PBS의 세척, 다음, 1 시간 동안 Cy3 - 방지 마우스 incubated 수 있습니다. </li><li> 측정 NEurite 길이 GFP 양성, 베타 - III tubulin의 긍정적인 뉴런의 이미지는 MC100 카메라 시스템 자이스 혈구 Axioskop에 인수됩니다. 여러 변수가 neurites의 분기, 모든 neurites의 길이, 가장 긴 neurite의 길이를 포함하여 이런 GFP 양성 세포 검사 수있는, 휴대 소마의 크기 등 우리는 아래로 노크 또는 유전자의 overexpression시의 연결 프로세스 가지를 분석하기 위해이 방법을 사용했을 의 연결 프로세스의 길이에 초점을 맞추고, neurodevelopment 및 neurodegeneration에 관한. 의 연결 프로세스의 가지를 측정하기 위해, 우리는 Axiovision LE 4.4 소프트웨어 (자이스 혈구에서)을 사용합니다. 이 소프트웨어 내에서 &quot;개요&quot;도구를 선택하는 옵션이 있습니다. 이 도구를 사용하여, 각각의 연결 프로세스의 길이를 추적하는 컴퓨터의 마우스를 사용할 수 있습니다. 그것은 당신이 당신의 neurites의 정확한 측정을 위해 사용하는 목적을 정의하는 데 중요합니다. 이러한 분석을 위해, 우리는 보통 20x 목적을 사용합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 우리는 스프 라그 돌리 쓰레기의 크기가 6 14 태아 사이의 범위 것으로 나타났습니다. 우리는 일반적으로 태아의 모든 electroporate. 각각의 배아는 DNAs의 다른 조합 electroporated 수 있습니다. 그러나, 우리는 일반적으로 dissociating 및 도금 전에 동일한 상태와 수영장이 머리로 최소한 네 머리를 electroporate. 우리는이 기술을 electroporated 두뇌의 약 75 % 그 지느러미 중간 또는 복부 측면 피질 (그림 1) 수 있는지 여부, 피질의 원하는 지역 타겟으로하는 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 Tbr1 긍정적인 계층 VI의 뉴런과 같은 E13 - 14 대상 깊은 계층 뉴런에서 조기 electroporations을 발견하면서 나중에 electroporations 긍정적인 목표 CTIP2, TBR1 부정적인 레이어 V 세포, 그리고 여전히 나중에 electroporations 대상 Brn2 긍정적인 레이어 II / III 세포 해야지. 의 피질에의 연결을 subtype 사양의 다른 마커와 설명 훌륭한 설명 Moleneaux 외 7 기사를 발견했습니다. 그림 2는 15.5 또는 17.5 배아 일 중 하나에서 electroporated 및 출생 후의 일 5 수확 두뇌의 코로나 부분을 보여줍니다. 빨간색으로 표시 Oct6 위해 immunostaining입니다. 당신이 타겟으로 어떤 세포 계층 집단 확인하기 위해 문화의 표식에 대한 immunostain 수 있습니다. 우리는 당신 같은 쓰레기의 모든 배아에서 세포의 동일한 셀 계층 인구를 대상으로 기대할 수 것으로 나타났습니다 (즉, 타겟팅은 오히려 그 다른 기술 변화에 배아 timepoint에 따라 다릅니다.) 문화, 긍정적인 GFP 아르 세포의 %가 널리 GFP 긍정적인 영역 (그림 3)을 해부 때 얼마나 보수에 따라 다양합니다. 그러나, 우리는 매우 보수적이며 세포에만 GFP 긍정적인 패치, 우리는 5-10 %입니다 관찰되는 가장 높은 비율을 해부하다 경우에도 - 당신이 electroporated했습니다 피질의 영역을 해부 있지만, 하나의 레이어에있는 세포 것입니다 대상 수 있습니다. 이 낮은 transfection의 effciency는 프로세스가 분석하고있는 electoporated 세포에 속해있는 식별에 도움이됩니다. 이 높은 밀도로 도금 세포가 heathier 문화를 가지고에 기여하지만, 그것은 프로세스가 속해있는 분별하기 어려운입니다 GFP 부정적인 세포 (그림 3)에있는 세포 기관. 문제가 electroporated 세포의 미세 프로세스를 모두 표시가있는 경우 (Invitrogen에서 둘 다 GFP의 표현을 높일 electroporating되는 GFP의 DNA의 농도를 증가하거나 방지 GFP 항체를 사용하여 dissociated 세포 immunostain 수 ) Cy2 차 항체와 함께. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. E15.5 스프 라그 - 돌리 쥐가 플라스미드 GFP와 electroporated 세 일 후에 수확했다. 전극의 위치에 따라, 피질의 다른 영역은 타겟이 될 것입니다. 전체 두뇌의 AF 표시 GFP 형광. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. E15.5 (A) 또는 E17.5 (B) 스프 라그 - 돌리 쥐는 출생 후의 일 5 GFP 플라스미드와 수확과 함께 electroporated되었습니다. 두뇌는 coronally vibratome를 (100 미크론 섹션)을 사용하여, sectioned 고정 및 Oct6 (적색)에 대한 immunostained되었습니다. A와 B는 immunostained 섹션의 공촛점 이미지를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. E15.5 스프 라그 - 돌리 쥐가 플라스미드 GFP와 electroporated되었습니다. electroporation 다음 24시간은 두뇌가 수확되었으며 GFP 양성, electroporated 지역은 동영상에 설명한 바와 같이, 해부 및 dissociated했다. 체외 3 일 후에, 세포는 고정 및 immunostained 빌 - tubulin (적색) 및 DAPI (블루) (A, C)과 핵 염색법했다. 가장 긴 neurite의 길이 Axiovision 소프트웨어를 사용하여 측정되었다(B, D).

<ol>
	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기본의 연결을 문화의 체외 연구에서 neurite 가지의 양적 분석을 위해 수 있습니다. 유전자 변경은 프로세스의 연결을 가지 영향을 미치는지 연구하기 위해, shRNA 또는 misexpression 구조는 화학 transfection 또는 바이러스성 전달을 통해 기본 뉴런에 소개하실 수 있습니다. 그러나, 기본 대뇌 피질의 세포와 세포 유형 (다른 레이어, 억제 신경, glial 세포에서 glutamatergic 뉴런)의 이질적인 수영장은 ?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cortical Neuron Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14185-052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14065-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630-080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dishes and Vials:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>
</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-547-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-554-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Tools:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91402-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Forceps</td>
<td>
</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11273-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11255-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Miscellaneous:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hand-Held Tally Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z169021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plating Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Growth Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEUROBASAL Medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX -I Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin Reagent Solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunostaining:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fixative, Washes, and Blocking Buffer:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>017-000-121 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibodies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>beta-III tubulin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>MAB1637</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAP2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB15452</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy3 anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>715-166-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy2 anti-chicken</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>703-226-155 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>D3571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide Preparation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>154852</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48393-106 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72180</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Ketamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>995-2949</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Xylazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>4015809TV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>1118217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTX square wave electroporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BTXECM830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450488</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

기본의 연결을 문화의 체외 연구에서 neurite 가지의 양적 분석을 허용합니다. 유전자 변경은 프로세스의 연결 가지, shRNA 또는 cDNA 구조는 화학 transfection 또는 바이러스성 전달을 통해 기본 뉴런에 도입 수있는 영향을 미치는지 연구하기 위해. 그러나, 기본 대뇌 피질의 세포와 세포 유형 (다른 레이어, 억제 신경, glial 세포에서 glutamatergic 뉴런)의 이질적인 수영장은 이러한 방법을 사용 transfected 있습니다. 배아 쥐 대뇌 피질의 DNA 구조를 소개 utero의 electroporation에의 사용 대상으로 세포의 특정 하위 집합을 허용 : 피질의 초기 배아 피질 대상 깊은 레이어 electroporation은 늦은 배아 timepoints에 electroporation은 더 많은 외면적인 레이어를 대상으로하면서. 또한, 피질의 지느러미 - 중간 대 복부 - 가로 영역의 대상에서 개별 배아 결과의 머리를 통해 전극의 차등 배치. electroporation 다음, transfected 세포는 밖으로 해부 dissociated와 neurite 가지의 정량 분석을 위해 체외에서 도금 수 있습니다. 여기, 우리는 양적 대뇌 피질 세포의 하위 집합에의 연결 프로세스 가지를 측정하기위한 단계별 방법을 제공합니다. utero의 electroporation에 대한 기본적인 프로토콜은 Kriegstein 연구실 1, 2에서 두 개의 다른 조브 기사에 자세히 설명되어있다. 우리의 연결 프로세스 가지의 유전자 기능 연구에 utero의 electroporation에 적용의 프로토콜에 대한 설명 다음에 가장 중요한 세부 사항에 초점을 utero의 electroporation에 우리의 프로토콜의 개요를, 제공할 것입니다.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.6K 조회수.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

비디오: In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

연구

신경과학

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...