אנו מודים במעבדה מרטין לדיונים מועילים. פרסום זה נתמך על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-89783). AM הוא נתמך על ידי פרס קנדה מחקר הקתדרה המשני.

שלב I: בידוד של תאים B הטחול באמצעות העשרה מגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי הניסוי צריך להיות בגיל 8-12 שבועות כדי להבטיח הבשלה מלאה של המערכת החיסונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומשרים אתנול 70%. ניתוח להסרת הטחול על ידי ביצוע חתך דרך העור והשריר של hypochondrium השמאלי של הבטן וחתכו אותה לשלושה חלקים גדולים פוספט בופר סליין (PBS). ודאו כי כל כלי ריאגנטים הם עקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסוף גומי של 1 מ&quot;ל במזרק הבוכנה, ומועכים בעדינות את הטחול דרך מסננת לתוך תא 70 מיקרומטר PBS. הקפד להשתמש תנועה דוחפים ולא בתנועה כמו שחיקה שחיקה עלול להוביל לקרע של (כלומר ריבוי) תאים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים בבית גרם לא יותר מ 350 במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב PBS. ספירת התאים resuspended באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה של 1x10 8 תאים / מ&quot;ל PBS עם נסיוב 5% חולדה נורמלית צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ&quot;ל עם מכסה (בנפח מרבי של 2 מ&quot;ל לכל צינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של עכבר EasySep שלילי לבחירה קוקטייל B העשרה תא עבור כל מ&quot;ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 קוקטייל μL EasySep ביוטין לבחירה עבור כל מ&quot;ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של חלקיקים מגנטיים EasySep (להבטיח חלקיקים מעורבבים היטב הפתרון הוא הומוגני) עבור כל מ&quot;ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון למעלה כדי 2.5mL עם PBS ומניחים מגנט EasySep במשך 5 דקות. היפוך המגנט ואת הצינורית ויוצקים במהירות לתוך צינור פוליסטירן חדש. אין לטלטל את הצינור כפי התאים שנבחרו באופן שלילי יהיה מחויב מגנטית על הקירות צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר עוד יותר את הטוהר של השעיה התא, הצינור יכול להיות לרחם לאבן שואבת עבור 5 דקות נוספות ושפך לתוך צינור חדש. זה עשוי להפחית את התאוששות התא הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא טוהר B ניתן להעריך על ידי ניתוח תזרים cytometric סמנים של משטח B התא. בעקבות העשרה, אנחנו בעקביות לראות טוהר&gt; 95% תאים חיוביים B220. </li></ol> שלב II: תא מכתים CFSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בתאים מבודדים PBS חם בתוספת בסרום שור 0.1% אלבומין בריכוז הסופי של 1 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 5mm של CFSE (בדילול מלא sulfoxide דימתיל סטרילי) ולהוסיף 2μL עבור מ&quot;ל כל התאים בצינור. הריכוז הסופי של 10μM הוא אופטימלי עבור מכתים של תאים B העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך (הערה: CFSE אור רגישים צריכים להיות כל הזמן בחושך כאשר הדבר אפשרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הכתם על ידי הוספת נפח שווה של נסיוב עגל שור לתאים שלך דוגרים על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי ציפוי את צינורות עם המדיום תרבות (ראה שלב III למתכון) ו centrifuging ב 350 גרם שים לב, לפחות 5 פעמים המקבילה נפח התקשורת יש להוסיף כדי לנטרל את הצמיגות של נסיוב עגל שור ועל התאים לייצר גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עוד פעמיים במדיום תרבות. התאים מוכנים כעת לגירוי. </li></ol> שלב III: גירוי נייד עם LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלך בינוני במבחנה B תרבית תאים על ידי משלים RPMI 1640 עם 10% נסיוב עגל עוברית 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני הגירוי שלך על ידי הוספת LPS בריכוז הסופי של 50μg/mL. 125 Aliquot μL של המדיום גירוי לבאר כל תחתית שטוחה 96-היטב בתרבות צלחת רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאים CFSE מוכתם שלך B במדיום תרבות ללא LPS בריכוז סופי של 3.2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. הוספת 125 μL של ההשעיה התא המכיל את הבארות בינוני הגירוי שלך ומערבבים ידי pipetting בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם עכשיו כל מכיל 4 x 10 5 תאים ריכוז LPS הסופי של 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל. זה מספק רמות אופטימליות של התפשטות תאים ומיתוג מעמד, למרות שינויים בערכים אלה עשויים להיות הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 72-96 שעות. לאחר 48 שעות, אשכולות גדולים של תאים B מתרבים יהיה לעין תחת מיקרוסקופ. </li></ol> שלב IV: ניתוח תזרים cytometric של מיתוג בכיתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן להסתכל מעבר בכיתה, להסיר את התאים מן התנאים תרבותם לשטוף אותם פעמיים מ&quot;ל 1 של חיץ מכתים (PBS עם 2% שור עגל נסיוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אי - נוגדן ספציפי מכתים של תאים שלך, גלולה התאים על ידי ספינינג אותם ב 350 גרם ו incubate אותם 100μL של מכתים חיץ עם נסיוב 5% עכבר רגיל 1μg של FcBlock per106 התאים במשך 15 דקות על הקרח. חסימת Cell צריכה להתבצע על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא כביסה התאים, להוסיף 1μg לכל 10 6 תאים של נוגדן מתויג fluorescently אנטי עכבר IgG3 ולאפשר לתאים כתם במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים על ידי צנטריפוגה ו resuspend ב μL 200-300 של חיץ מכתים. התאים מוכנים כעת להערכה על ידי cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CFSE הוא מתרגש בצורה אופטימלית ב 492 ננומטר (על ידי ארגון יון לייזר) ופולט ב 517 ננומטר. ספקטרום עירור ופליטה של ​​הנוגדן IgG3 תלויה צבע פלואורסצנטי המצומד שלה. </li></ol> נציג תוצאות בעקבות העשרה מגנטי, על השעיית התא אמור להיראות אוכלוסייה הומוגנית של נבדל תאים עגולים קטנים (איור 1 א). לאחר 48-72 שעות של גירוי, אשכולות של תאים בודדים מתרבים מוגדל יהיה נראה בבירור (איור 1B). חלק גדול של תאים שאינם מתרבים יופיעו קטנים פרטנית כפי שהם עוברים אפופטוזיס. אחריות חברתית בדרך כלל, ניתן להבחין ברמות הגבוהות ביותר בין 72 ו - 96 שעות לאחר גירוי לפני רוב התאים מתחילים למות 7. בשלב זה, התאים צריכים עבר מספר חלוקות תא עם תאים החליף המופיעים האוכלוסייה בתו לאחר מכן התא. תזרים נציג העלילה cytometric של דילול CFSE וביטוי פני השטח של IgG3 לאחר 96 שעות של גירוי LPS ניתן לראות באיור 2. טבלה 1. אלוטיפ מיתוג קוקטיילים. הערה: ריכוז הערכים ממריצות הן המלצות בלבד. Titrations עשוי להיות נחוץ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רצוי אלוטיפ </td><td> גירוי קוקטייל </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> LPS (25μg/mL) ו-IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> Anti-CD40 (10μg/mL) ו-IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) ו - IFN-γ (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2b ו IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> IgA </td><td> LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / mL) ו-IL-5 (1.5 ng / mL) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בידוד גירוי LPS בתאי B הטחול. (א) מועשר מגנטית תאים B הטחול לפני גירוי LPS. (ב) 48 שעות לאחר גירוי עם 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של LPS. התאים מתרבים נתפסים אשכולות ברקע של תאים אפופטוטיים פיצוץ ו. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הפצת נשק ולעבור רקומבינציה הכיתה לאחר 96 שעות. (א) דילול CFSE עבור LPS מגורה בתאים לאחר 96 שעות בתרבות. כל שיא עצמאית מהווה דילול של הקרינה CFSE המתאים חלוקת תאים עצמאיים. (ב) הביטוי IgG3 המציג את צמיחתה של האוכלוסייה IgG3 חיובית בעקבות כמה סיבובים של חלוקת התא.

<ol>
	<li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number.">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li><li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes.">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li><li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination.">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li><li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells.">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNF8/RNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination.">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li><li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis.">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li><li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class-switch+recombination:+interplay+of+transcription,+DNA+deamination+and+DNA+repair.">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha,+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b.">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li><li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+class+switching+differs+among+SJL,+C57BL/6+and+129+mice.">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול שתוארו לעיל מספק assay תקן לנתח ביטוי סיוע לתפקד במהלך מיתוג המעמד העיקרי של תאים B Murine. פרוטוקול זה משתמש LPS בקטריאלי כדי לגרום מעבר מ IgM כדי IgG3, למרות שינויים בתקשורת הגירוי יכול להתבצע לגרום מעבר isotypes אחרים (מסוכמים בטבלה 1 8, 9). <p class="jove_content" style=";text-align:rig...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemcell Technologies</td>
<td>19754</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Falcon</td>
<td>352058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34554</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 Culture Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L6529</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30396.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>011-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Anti-Mouse IgG3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson Pharmingen</td>
<td>553401</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

induction and assessment of class switch recombination in purified murine b cells

חסינות הלחות היא ענף של המערכת החיסונית ומתוחזק על ידי תאים B ו מתווכת באמצעות הפרשה של נוגדנים. עם הפעלת תא B, מוקד אימונוגלובולינים עוברת סדרה של שינויים גנטיים כדי לשנות את קיבולת מחייב מפעיל פונקציה של נוגדנים מופרשים. תהליך זה מודגש על ידי אירוע רקומבינציה גנטי המכונה רקומבינציה בכיתה מתג (CSR) שבו IgM מחדל אלוטיפ נוגדן הוא החליף את אחד IgG, IgA או IgE. אלוטיפ כל בעל פונקציות שונות ובכך מפעיל אחריות חברתית חיונית לשמירה על חסינות. גיוון של מוקד אימונוגלובולינים מתווכת על ידי דאמינז הפעלה-Induced cytidine אנזים (AID). וידאו סכמטי המתאר את התהליך בפירוט זמינה באופן מקוון (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). פעילות של סיוע מסלול CSR נלמדים בדרך כלל הערכה של תפקוד התא B ו חסינות הלחות בעכברים. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מציג שיטה של ​​בידוד תא B מ spleens Murine וגירוי לאחר מכן עם lipopolysaccharide חיידקי (LPS) כדי לגרום מעמד מעבר IgG3 (עבור isotypes נוגדנים אחרים ראו טבלה 1). בנוסף, מכתים פלורסנט התא לצבוע Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) משמש כדי לפקח על חלוקת התא של תאים מגורה, תהליך חיוני אלוטיפ מיתוג 1, 2. הסדרת הסיוע את המנגנון שבאמצעותו CSR מתרחשת עדיין אינם ברורים ולכן בבורר מבחני חוץ גופית בכיתה לספק שיטה אמינה לבדיקת תהליכים אלה במודלים של עכברים שונים. מבחני אלו שימשו בעבר בהקשר של חוסר גנטי באמצעות עכברים knockout 3. יתר על כן, במבחנה מיתוג של תאים B יכול להיות קדמו התמרה ויראלית לווסת ביטוי גנים על ידי מציאה RNA או ביטוי transgene 4-6. נתונים אלו סוגים של ניסויים השפיעו ההבנה שלנו של פעילות AID, ברזולוציה של התגובה CSR, ואת הנוגדנים בתיווך חסינות העכבר.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells at JoVE.com

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם ונותחו<em&gt; במבחנה</em&gt; לצורכי לימוד פונקציה B התא.

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Views.  University of Toronto. בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם ונותחו במבחנה לצורכי לימוד פונקציה B התא.

Video: Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

הערכה של מאפייני המערכת החיסוניים של תאי גזע mesenchymal האדם (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA recombination (CSR), and plasma cell differentiation. In recent years, epigenetic modifications or factors, such as histone deacetylation and microRNAs (miRNAs), have been shown to interact with B-cell genetic programs to shape antibody responses, while the dysfunction of epigenetic factors has been found to lead to autoantibody responses. Analyzing genome-wide miRNA and mRNA expression in B cells in response to epigenetic modulators is important for understanding the epigenetic regulation of B-cell function and antibody response. Here, we demonstrate a protocol for inducing B cells to undergo CSR and plasma cell differentiation, treating these B cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors (HDIs), and analyzing mRNA and microRNA expression. In this protocol, we directly analyze complementary DNA (cDNA) sequences using next-generation mRNA sequencing (mRNA-seq) and miRNA-seq technologies, mapping of the sequencing reads to the genome, and quantitative reverse transcription (qRT)-PCR. With these approaches, we have defined that, in B cells induced to undergo CSR and plasma cell differentiation, HDI, an epigenetic regulator, selectively modulates miRNA and mRNA expression and alters CSR and plasma cell differentiation.

Epigenetic factors can interact with genetic programs to modulate gene expression and regulate B cell function. By combining in vitro B-cell stimulation, qRT-PCR, and high-throughput microRNA-sequence and mRNA-sequence approaches, we can analyze the epigenetic modulation of miRNA and gene expression in B cells.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.