עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIAID (R01AI074951, U54AI057168) ו הגנום פן גבולות מכון SC, מ-NIH T32HG000046 ל TSM, מ-NIH T32GM07229 ו T32AI007324 כדי LRS.

חלק 1: RNAi ב 384 צלחות טוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקינה של חומרים כימיים המשמשים ההקרנה היא חיונית. אנחנו בודקים הרבה הפרט התקשורת של שניידר, בסרום שור העובר, וכן חומרים כימיים מכתים. אז אנחנו aliquot ולהשתמש הרבה באותו המסך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל assay, עדיף לבדוק כמה שורות תאים שונות כדי לקבוע אילו הוא נוח ביותר לקריאה מתוך הביולוגי שלך. אנו משתמשים בדרך כלל את קו-S2 DRSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים תסיסנית במהירות של 25 ° C בתקשורת שניידר להשלים. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שניידר התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום FBS 10% מומת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X-L-גלוטמין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X פן / דלקת אנטיביוטיקה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תסיסנית הם חצי חסיד והם passaged ללא trypsinization כל ארבעה ימים על ידי pipetting התאים את צלוחיות ו דילול תאים 1:10 לתוך בקבוק טרי. תאים צריכים להיות בשלב יומן לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט אל הצלחת יום יומית השתנות הן מזעריות באמצעות טיפול הנוזל אוטומטית כל התוספות נוזל רב גם הצלחות. אנו משתמשים WellMate (מטריקס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות WellMate. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס ברדס WellMate עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות מהאריזה ולרסס עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קלטת צינורות ב מחלק עמדה על WellMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור ראש עם 25 מ&quot;ל של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר צינורות באתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן עם ראש הממשלה עוד 25 מ&quot;ל של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בצינור על ידי תחול עם 50 מ&quot;ל של PBS סטרילית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק תאים מן הבקבוק ולספור. תאים גלולה, כך יש לך 25% יותר מאשר הצורך (300xg, 5 דקות). מספר תאים seeded לכל טוב חייב להיות מותאם על פי אורך assay. כאשר עורכים ניתוח התמונה אוטומטית, monolayer יחיד עם תא clumping לא אידיאלי פילוח התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים pelleted בסרום ללא מדיה של שניידר בבית 1.7x10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מבצעים את המסך ב 384 צלחות היטב מראש aliquoted עם ספרייה זמינים מסחרית של dsRNA בריכוז של 250ng/well. בארות כמה כל צלחת נותרים ריקים עבור פקדים, אשר מתווספים באופן ידני. אנו משתמשים dsRNA כדי בלוציפראז כביקורת שלילית. אנו משתמשים dsRNA נגד אשכול (dIAP) כביקורת על החזקה RNAi. להפיל זה אנטי אפופטוטיים תוצאות גורם מוות של תאים דרמטית היא דרך ויזואלית מהירה להעריך את איכות לדפוק למטה. לבסוף, אנו משתמשים dsRNA נגד הכתב ויראלי, במקרה הזה בטא galacosidase, כביקורת חיובית כדי לאמת כי אנו יכולים למנוע זיהום ויראלי באמצעות assay שלנו לקריאה החוצה. אם אכון dsRNA לתוך צלחת בזמן זריעת תאים, 1 aliquot dsRNA μl לפינה הבאר על מנת לאפשר ראיה קל, אז צנטריפוגות dsRNA אל תחתית הבאר (300xg, 1 דקות) לפני הוספת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש WellMate להוסיף 10 תאים μL מוכן היטב מעל כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לצלחות ידי centrifuging 300xg, 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 25 ° C בחממה במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה 20 μL שלם של שניידר צנטריפוגות 300xg, 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מקום humidified מיכלי פלסטיק מלאים מים ספוג מגבות נייר. נפח של 384 גם הוא קטן, ולכן אידוי יכולה להיות השפעה גדולה על הביולוגיה, אשר בתורו יכול להוביל שינויים artifactual ב-outs לקרוא את בארות קצה. כדי להתגבר על זה, צלחות צריך להישמר תחת לחות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שלושה ימים כדי לאפשר מציאה חזקים. אין צורך לשנות את התקשורת או לפתוח מכולות humidified בתקופה זו. </li></ol> חלק 2: הדבקה עם וירוס Vaccinia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מרובת ערוצים aspirator ב Quatricide במשך 15 דקות, ואז לשטוף באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן WellMate כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת של שניידר עם 2% FBS נגוע דילול מלא בתקשורת 01:05 בתקשורת חופשית בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות סינון וירוסים גולמי באמצעות מזרק 0.8 אממ לסנן להסיר פסולת הסלולר או להשתמש וירוס מטוהרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל וירוס vaccinia בתקשורת 2% בסרום של שניידר להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS מתוך צינורות WellMate, וראש בווירוס מדולל עד בצינור ללא בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מעוקרים מרובת ערוצים aspirator ו סעפת ואקום כדי להסיר בעדינות התקשורת מהצלחות של dsRNA שטופלו בתאים תסיסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 30 לכל וירוס μL גם על הצלחות באמצעות WellMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות 1 דקות ב 300xg. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר צינורות WellMate. ראש עם 25 מ&quot;ל של blea 10%ch, להמתין 10 דקות, ממשלה עם אקונומיקה עוד 25 מ&quot;ל 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור ראש עם 50 מ&quot;ל מים ואחריו 50 מ&quot;ל אתנול 70%. חזור אל צינורות האריזה שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחות קופסת פלסטיק humidified. דגירה של 25 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li></ol> חלק 3: פלטות מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן צלחות בפורמלין 15% μL 4 / PBS למשך 10 דקות. נוזלי מוסר באמצעות aspirator מרובת ערוצים ו סעפת ואקום בכל שלב. לאחר הצלחות תוקנו, ציוד סטרילי ריאגנטים אינם נחוצים עוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לתקן ולהשתמש WellMate להוסיף 30 PBST μL (PBS + 0.1% Triton-X). דגירה 10 דקות וחזור. Operate WellMate כמתואר לעיל, למעט צינורות לא צריך לעבור עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות זיהום vaccinia נשתמש כתב β-galactosidase מונע על ידי האמרגן vaccinia מוקדם / מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים נוזלי דגירה בבלוק (PBST עם BSA 2%) במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל הנוגדן העיקרי לחסום, להסיר נוזלי להוסיף 15 נוגדן μL כדי pipettor גם שימוש רב ערוצי כל לחזור (מטריקס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה צלחות (300xg, 1 דקות), לכסות עם מדבקה ברורה, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדן ראשוני, ולהשתמש WellMate לשטוף בארות PBST 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (FITC) ו גרעיני כתם בבלוק, ולהוסיף 15 μL לבארות באמצעות Multi-channel לחזור pipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות PBST 3 פעמים, 10 דקות כל אחד באמצעות WellMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם צלחת עם מדבקה לכסות ברור, ולאחסן ב 4 ° C עד שלושה שבועות. </li></ol> חלק 4: הדמיה וניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ בהגדלה 20X אוטומטית אל צלחות התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של גרעינים הכולל (DAPI) לבין תאים נגועים (FITC). מטב את זמן החשיפה לכל ערוץ בנפרד על מנת למקסם טווח דינמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונן את פונקציית המיקוד האוטומטי על ידי לקיחת Z ערימה של תמונות, 1um ברווח מזה, כי ההיקף המטוסים מעל ומתחת למישור הצפוי של המוקד. ברגע שהמטוס נמצא מוקד אופטימלי, פוקוס אוטומטי להתאים את ההגדרות בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה את הצלחת כולה, לכידת לפחות שלוש תמונות לכל היטב הן את ערוץ Hoechst (DAPI) ואת ערוץ וירוס (FITC). בחירת האתרים מאזורים שונים בתוך שנה אחת גם כדי ללכוד תמונות שמייצגות את גם כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש MetaXpress תוכנה לכתוב יומן לפלח את התמונה והשתמש גרעינים מודולים הרוזן כדי לחשב את המספר הכולל של תאים חיובית מכתים גרעיני (תאים סה&quot;כ) וזיהום (FITC) עבור כל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב זיהום אחוז (100 תאים * FITC חיובי / סה&quot;כ) והיכנס לשנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות מועמדים אנו משתמשים ציון חזקים Z מבוסס על טווח חציון interquartile של כל צלחת. שיטה זו היא רגישות חריגים ונתונים nonsymmetric, ולכן מספק כוח גדול יותר בזיהוי אפילו מכה חלשה או בינונית 10. במשך כל צלחת, החציון הוא ונוכו מנתוני log-טרנספורמציה. ואז הערכים שהתקבל מחולקים לפי 0.74 פעמים את טווח interquartile (ההפרש בין הערכים של האחוזון ה 75 לבין אחוזון 25 ה). גורם 0.74 משמש הפצה משוער נורמלית סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציון חזקים Z הוא מדד של מרחק סטיות תקן מן הממוצע של הצלחת. לדוגמה, החזקה Z-ציון של 2% מצביע על זיהום של הבאר הוא ~ 2 סטיות תקן מן החציון צלחת או p &lt;0.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח מספר תאים כדי לזהות המועמדים ציטוטוקסיות. חישוב הציון חזקים Z של ספירת גרעיני. מועמדים בעלי החזקה Z &lt;ב -2 מסכי לשכפל נחשבים ציטוטוקסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וולס כי יש ציון חזקים Z לזיהום אחוז&gt; 2 או &lt;ב -2 מסכי כפולות (p &lt;0.0025) ללא cytotoxicity נחשבים מועמדים פוטנציאליים מהמסך הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מועמדים חיובית מאומתים באמצעות ריאגנטים עצמאית. dsRNAs נוצרות נגד גנים עניין מאזור אחר של mRNA ונבדק לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנים אלה עבור שבו שני dsRNAs עצמאית יש פנוטיפ זהה יכול להיחשב למחקר נוסף. </li></ol> חלק 5: תמונות נציג ופרשנות של בשיעורי הזיהום <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בארות נגוע לא מראים מכתים עבור חלבונים vaccinia וירוס, בעוד נציג נגועים גם מכיל תאים מכתים חיובית vaccinia, הביע חלבון (βgal) בטא galactosidase, כפי שנמדד על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.וירוס = ירוק, כחול = גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוכנה אוטומטיות ניתוח התמונה מכמת זיהום כל תמונה באמצעות פרמטרים הנקבעים על ידי המשתמש. בתמונה נציג, המספר הכולל של גרעין התא ואת מספר התאים לבטא אנטיגן נגיפי נספרים בהתבסס על גודל ועוצמת מכתים מעל מכתים את הרקע המקומי. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מציאה של חוט (dIAP) משמש כביקורת חיובית דלדול RNAi החזקה של גני מטרה. מציאה של גורם אנטי אפופטוטיים זה מוביל מוות של תאים דרמטי. גרעינים = כחול. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. מציאה של בלוציפראז משמש בקרה שלילית ההשפעה של טיפול RNA פעמיים תקועים על זיהום. דלדול בלוציפראז אין כל השפעה על זיהום ביחס לתאים אינה מטופלת כראוי. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. מציאה של חלבון βgal משמש שליטה חיובית לצמצום הזיהום, שכן assay משתמשת רמות החלבון βgal כמו לקרוא בקול של זיהום. דלדול של תוצאות βgal לירידה באחוז התאים הנגועים. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. מציאה של הסלולר Rab5 תוצאות גורם לירידה באחוז התאים הנגועים. מאז Rab5 ידוע להשתתף אנדוציטוזה, גורם זה עשוי תורם כניסה וירוס vaccinia. זה מייצג outlier דוגמה מן המסך. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני.

<ol>
	<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells.">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li><li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response.">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li><li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells:+regulation+of+viral+transcription+and+replication.">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li><li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors.">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells:+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions?.">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?.</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li><li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication.">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication.">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition.">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li><li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics.">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הגנום כולו ההקרנה RNAi ב תסיסנית מספק שיטה חזקה ויעילה לבחינת רכיב הסלולר של זיהום ויראלי. מספר וירוסים להדביק תאים יונקים תסיסנית, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את המרכיבים של התגובה החיסונית המארח מהותי, וחלבון מארח הגורמים הנדרשים שכפול נגיפי זה עשוי לייצג מטרה טיפולית חדשנית. לפני ביצוע מסך, assay חייב להיות מותאם בקפידה את סוג התא, מספר התאים, רמת זיהום, חייבים להיות מבוקרים היטב, כולל חיוביים ושליליים נגיפיים 11 יעדים סלולריים. חשוב להבטיח הפרדה מספקת בין בקרות חיוביות ושליליות לפני ההקרנה על מנת למקסם את הטווח הדינמי של assay. לאחר מסך שבוצעה, המועמדים יכולים להיות מחולקים לקטגוריות תפקודית כדי לקבוע אילו מנגנוני מארח לתרום לזיהום. עבור וירוסים יונקים כגון vaccinia, התרומה של homologs יונקים ידי RNAi צריך להיקבע במסגרת ניתוח משני. יחדיו, אלה שיטות ההקרנה החזקה תאפשר לנו לקבל תובנות לגבי מנגנונים מורכבים על ידי וירוסים אשר אינטראקציה עם תאים המארח שלהם.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screening</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Genome-wide dsRNA library</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plates, black with clear bottom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>6569</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denville</td>
<td>B1212-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Well Mate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matrix</td>
<td>201-10001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 pin manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B2261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescently-labeled secondary antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageXpressMicro automated microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MetaXpress image analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells

פתוגנים ויראליים מהווים איום משמעותי על בריאות הציבור, לא רק וירוסים יכולים לגרום מגיפות טבעי של מחלות אנושיות, אך השימוש הפוטנציאלי שלהם טרור ביולוגי היא גם דאגה. הבנה טובה יותר של הגורמים הסלולר כי השפעת זיהום יקל על פיתוח נחוצה הרפוי. התפתחויות אחרונות בתחום הטכנולוגיה RNA (RNAi) הפרעה יחד עם רצף הגנום המלא של אורגניזמים אחדים הובילה אופטימיזציה של הגנום כולו, מבוססי תאים הפסד של פונקציה המסכים. תאים תסיסנית הנוחות במיוחד הגנום בקנה מידה מסכי בגלל הקלות והיעילות של RNAi במערכת זו 1. חשוב לציין, מגוון רחב של וירוסים יכולים להדביק תאים תסיסנית, כולל מספר וירוסים יונקים בעלי חשיבות רפואית חקלאי 2,3,4. הקודם מסכי RNAi ב תסיסנית זיהו גורמים מארח הנדרשים בפעולות שונות על זיהום בנגיף כולל כניסה, תרגום, שכפול רנ&quot;א 5. יתר על כן, רבים מן הגורמים הסלולר נדרש שכפול נגיפי בתרבות התא תסיסנית גם הגבלת בתאים אנושיים נגועים אלו וירוסים 4,6,7,8, 9. לכן, זיהוי של גורמים מארח לאייש במהלך זיהום ויראלי מציג מטרות הרומן ותרופות אנטי. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית עבור מסך RNAi תפוקה גבוהה לזהות גורמים הסלולר מעורב זיהום ויראלי, באמצעות וירוס vaccinia כדוגמה.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells at JoVE.com

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.<em&gt; תסיסנית</em&gt; תרבות מודל התא הוא נוח במיוחד גישה זו בשל הקלות והיעילות של RNAi. כאן אנו מדגימים את הטכניקה הזו באמצעות<em&gt; Vaccinia</em&gt; וירוס כדוגמה.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

9.4K Views.  University of Pennsylvania. המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד. תסיסנית תרבות מודל התא הוא נוח במיוחד גישה זו בשל הקלות והיעילות של RNAi. כאן אנו מדגימים את הטכניקה הזו באמצעות Vaccinia וירוס כדוגמה.

Video: RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...