この作品は、NIAID（R01AI074951、U54AI057168）とSCにペンゲノムフロンティア研究所からの補助金によって支えられて、NIH T32HG000046からTSMに、NIH T32GM07229とT32AI007324からLRSに。

パート1：384ウェルプレートでのRNAi <ol><li>スクリーニングに用いる試薬の標準化が不可欠です。我々はシュナイダーのメディアの個々のたくさんの、ウシ胎児血清、および染色試薬をテストします。その後、我々は、分注して、画面全体のための同一ロットを使用してください。 </li><li>任意のアッセイの場合、それは、読み出して生物学的に最も適しているかを判断するためにいくつかの異なる細胞株をテストするのが最適です。我々は通常、S2 - DRSCラインを使用してください。 </li><li> 25℃で完全なシュナイダーのメディアでショウジョウバエの細胞を成長する。 <ol class="lalpha"><li>シュナイダーのメディア</li><li> 10％の熱不活化FBS </li><li> 1X L -グルタミン</li><li> 1Xのペン/連鎖球菌抗生物質</li></ol></li><li> ショウジョウバエの細胞は半接着性であり、フラスコから細胞をピペッティングし、新鮮なフラスコに1時10分、細胞を希釈して4日ごとにトリプシン処理することなく継代されています。細胞は実験の対数増殖期にある必要があります。 </li><li>プレート間のプレートと日々の変動は、マルチウェルプレートにすべての液体の追加のための自動液体ハンドリングを使用することによって最小限に抑えられています。我々はWellMate（マトリックス）を使用してください。 </li><li> WellMateチューブを準備します。 <ol class="lalpha"><li> 70％エタノールでスプレーフードとWellMate。 </li><li> 70％エタノールで包装し、スプレーのチューブを取り外します。 </li><li> WellMate上の位置を調剤にチューブカセットを挿入します。 </li><li> 70％エタノール25mLの素チューブ。 </li><li>エタノールの別の25 mLのその後素数15分、のためのエタノールのチューブを滅菌する。 </li><li>滅菌PBS 50 mLでプライミングによってチューブを洗浄します。 </li></ol></li><li>フラスコとカウントから細胞を取り除きます。細胞をペレット化するために必要なよりも25％以上を持つように（300xg、5分）。ウェルあたり播種する細胞の数は、アッセイの長さに応じて最適化する必要があります。自動画像解析を行う際に、無細胞の凝集を持つ単一の単層は、画像のセグメンテーションに最適です。 </li><li> 1.7 × 10 6細胞/ mLで無血清シュナイダーのメディアでペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>我々は、384ウェルプレート250ng/wellの濃度でdsRNAの市販のライブラリーが事前に小分けに画面を実行します。各プレートのいくつかのウェルを手動で追加されたコントロール、のために空のままにされています。我々は、ネガティブコントロールとしてルシフェラーゼにdsRNAを使用。我々は、堅牢なRNAi実験のコントロールとして（dIAP）スレッドに対するdsRNAを使用してください。劇的な細胞死でこの抗アポトーシス因子の結果のノックダウンとダウンノックの品質を評価するために迅速に視覚的な方法です。最後に、我々は我々のアッセイを読んでアウトを使用してウイルス感染を阻害することができることを検証するためにポジティブコントロールとして、この場合はβ- galacosidaseで、ウイルスのレポーターに対してdsRNAを使用してください。一定分量1μlのdsRNAが簡単に可視化を可能にするためにものコーナーに、細胞播種の時にプレートにdsRNAをスポッティングした場合は、セルを追加する前に、井戸の底（300xg、1分）にdsRNAを遠心してください。 </li><li>各ウェルに上記で調製した10μLの細胞を追加するWellMateを使用してください。 </li><li> 300xg、1分を遠心分離することによってプレート上に細胞を回転させる。 </li><li> 45分間25℃インキュベーターでインキュベートする。 </li><li> 20μLの完全シュナイダーのメディアを追加し、300xg、1分遠心してください。 </li><li>加湿タッパーウェアの容器に入れプレートは水浸状のペーパータオルを敷いた。 384の量は十分小さく、したがって、蒸発は順番に、エッジの井戸のリードアウトの人為的な変化につながることができる生物学、大きな影響を持つことができます。これを克服するために、プレートは、高湿度下で維持されるべきである。 </li><li>堅牢なノックダウンを可能にするために三日間インキュベートする。この期間中にメディアまたはオープン加湿容器を変更する必要はありません。 </li></ol>パート2： ワクシニアウイルスで感染する<ol><li> 15分間Quatricideでマルチチャンネルの吸引器を殺菌し、70％エタノールでリンス。 </li><li>上記のようにWellMateを準備します。 </li><li>無血清培地での完全なメディア1:5に希釈して感染を2％FBSとシュナイダーのメディアを準備します。 </li><li>細胞残渣を除去または精製されたウイルスを使用するフィルタ0.8 UMシリンジを介してフィルタ原油ウイルスストック。 </li><li> 2の感染の多重度（MOI）を取得するには、2％血清シュナイダーのメディアにワクシニアウイルスを希釈する。 </li><li> WellMateチューブからPBSを外し、チューブが気泡の自由になるまで希釈したウイルスと素数。 </li><li>静かにdsRNAを処理したショウジョウバエの細胞のプレートから培地を除去する滅菌マルチチャンネルアスピレーターと吸引マニホールドを使用してください。 </li><li> WellMateを使用してプレートにウェルあたり30μLのウイルスを分注する。 </li><li> 300xgでプレート1分間遠心します。 </li><li> WellMateチューブを滅菌する。 10％のブリー25mLの素チャンネル、10分待ってから別の25 mLの10％の漂白剤と素数。 </li><li> 50mLの70％エタノール、続い50mLの水素チューブ。その包装にチューブを返します。 </li><li>加湿タッパーウェアの容器にプレートを返します。 48時間25℃でインキュベートする。 </li></ol>パート3：染色プレート<ol><li> 10分15μLを4％ホルムアルデヒド/ PBSでプレートを固定してください。液体は、各ステップでマルチチャンネルの吸引器と吸引マニホールドを使用して削除されます。一度プレートが固定されている、滅菌された器具や試薬が不要になります。 </li><li>削除修正して30μLPBST（PBS + 0.1％トリトン- X）を追加するWellMateを使用してください。 10分とリピートをインキュベートする。チューブは滅菌する必要がない場合を除き、上記のようWellMate動作する。 </li><li> ワクシニア感染を検出するために我々は、初期/後期ワクシニアプロモーターによって駆動されるβ-ガラクトシダーゼのレポーターを使用してください。 </li><li> 10分間ブロック（2％BSAを含むPBST）で液体とインキュベートセルを削除します。 </li><li>ブロック内で一次抗体を希釈して、液体を除去し、各ウェルのマルチチャネルを用いた繰り返しピペッター（マトリックス）に15μLの抗体を加える。 </li><li>プレート（300xg、1分）スピンダウン、明確なステッカーでカバーし、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>一次抗体を削除し、PBSTで3回、10分ごとに井戸を洗浄するWellMateを使用してください。 </li><li>蛍光標識二次抗体（FITC）と核ブロックで染色、およびマルチチャンネルのリピートピペッターを使用してウェルに15μLを追加して希釈する。 </li><li>プレートを、室温で1時間は、光から保護。 </li><li> WellMateを使用してPBSTで3回、10分ごとに井戸を洗浄する。 </li><li> 4で明確なステッカー、カバー、およびストアでプレートをシール° Cまで3週間。 </li></ol>パート4：イメージングと画像解析<ol><li>イメージングプレートに20倍の倍率で自動化された顕微鏡を使用してください。 </li><li>合計核（DAPI）と感染細胞（FITC）の画像をキャプチャ。ダイナミックレンジを最大化するために、個別に各チャネルごとに露光時間を最適化する。 </li><li>焦点の予想される平面の上下面にまたがる画像を、間隔をあけ1um、のZスタックを取ることによってオートフォーカス機能を微調整します。最適な焦点面が配置されると、それに応じてオートフォーカスの設定を調整します。 </li><li>画像全体のプレート、ヘキストチャンネル（DAPI）とウイルスのチャンネル（FITC）の両方に1ウェルあたり、少なくとも3つの画像をキャプチャする。全体として十分に表すイメージをキャプチャするためにも一つの中にいくつかの異なる地域からのサイトを選択してください。 </li><li>セグメントにイメージをジャーナルを書き、それぞれのプレートのための核染色（総細胞）や感染（FITC）のための陽性細胞の合計数を計算するには、Countの核のモジュールを使用するソフトウェアをMetaXpress使用。 </li><li>パーセントの感染症（100 * FITC陽性/総細胞）を計算し、変換ログオンします。 </li><li>候補者を識別するために我々は、各プレートの中央値と四分位範囲に基づいて、堅牢なZスコアを使用してください。このメソッドは、外れ値や非対称データに鈍感であり、そのためにも弱または中程度のヒット10を特定するのに大きな力を提供します。各プレートについて、中央値は、対数変換したデータから減算されます。次に、得られた値は、0.74倍の四分位範囲（75パーセンタイルの値と25 パーセンタイルの間の差）によって分けられています。 0.74係数が近似標準正規分布に使用されます。 </li><li>堅牢なZスコアは、プレートの中央値から標準偏差の距離の尺度です。たとえば、2の堅牢なZ -スコアは、井戸の％の感染がプレートの中央値またはp &lt;0.05から〜2標準偏差であることを示します。 </li><li>細胞毒性の候補を識別するために、細胞数を分析する。核カウントの堅牢なZスコアを計算する。重複画面で堅牢なZ &lt;-2を持つ候補者は細胞毒性とみなされます。 </li><li>細胞毒性なし、重複画面で&gt; 2または&lt;-2（P &lt;0.0025）のパーセント感染の堅牢なZスコアを持っている井戸は、一次画面からの潜在的候補と見なされます。 </li><li>肯定的な候補者は、独立した試薬を用いて検証されます。 dsRNAはmRNAの別の領域から興味のある遺伝子に対して生成され、上記のように試験されています。 </li><li>二つの独立したdsRNAは、同じ表現型を所持している遺伝子は、さらなる研究のために考えることができる。 </li></ol>パート5：代表画像と感染率の解釈<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="図1" /> よく感染の代表がのような免疫蛍光顕微鏡で測定したワクシニア発現するβ-ガラクトシダーゼ（βgal）蛋白質、のために陽性染色細胞を含んでいるときに、 図1。非感染の井戸は、 ワクシニアウイルスのタンパク質のいずれかの染色を示していない。ウイルス=緑、核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="図2" /> 図2自動画像解析ソフトウェアは、ユーザが設定したパラメータを用いて各画像に感染を定量化する。代表的なイメージでは、細胞核やウイルス抗原を発現する細胞の数の合計数は、サイズおよびローカルバックグラウンド染色の上に染色の強度に基づいてカウントされます。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。スレッド（dIAP）のノックダウンは、標的遺伝子の堅牢なRNAiの枯渇のためのポジティブコントロールとして機能します。この抗アポトーシス因子のノックダウンは、劇的な細胞死につながる。核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。ルシフェラーゼのノックダウンは、感染に対する二本鎖RNAの治療の効果のためのネガティブコントロールとして機能します。ルシフェラーゼの枯渇は、放置細胞への相対的な感染には影響しません。ウイルス=緑、核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="図5" /> 感染から読み出さとしてアッセイはβgalタンパク質レベルを使用するので、 図5。βgalタンパク質のノックダウンは、感染症の減少のためのポジティブコントロールとして機能します。感染細胞の割合の減少にβgal結果の枯渇。ウイルス=緑、核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。細胞因子のノックダウン感染細胞の割合の減少のRab5の結果。 Rab5のエンドサイトーシスに関与することが知られているので、この要因は、おそらくワクシニアウイルスのエントリーに貢献しています。これは、画面から例の外れ値を表します。ウイルス=緑、核=青。

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	<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells.">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li><li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response.">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li><li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells:+regulation+of+viral+transcription+and+replication.">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li><li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors.">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells:+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions?.">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?.</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li><li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication.">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication.">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition.">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li><li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics.">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエのゲノムワイドなRNAiスクリーニングでは、ウイルス感染の細胞成分を調べるための、堅牢で効率的な方法を提供する。哺乳類のウイルスの数は、ホスト固有の免疫応答の構成要素を識別するために使用できるショウジョウバエの細胞を、感染、および新たな治療標的を表す可能性があるウイルス複製に必要なタンパク質因子を開催。画面を実行する前に、アッセイは、慎重に細胞型、細胞数、および感染のレベルに合わせて最適化しなければならない、とも正と負のウイルスおよび細胞標的11の両方を含む、制御しなければならない。アッセイのダイナミックレンジを最大にする前にスクリーニングにポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間の十分な分離を確保することが重要です。画面が実行されたら、候補者は、ホストのメカニズムは、感染症に寄与するかを決定するために機能的なカテゴリに分けることができます。 ワクシニアなどの哺乳動物ウイルスの場合は、RNAiによる哺乳動物のホモログの寄与は、二次分析の一環として決定されるべきである。一緒に、これらの堅牢なスクリーニング法は、私たちは、ウイルスが宿主細胞と相互作用することによって、複雑なメカニズムを把握することができます。

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screening</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Genome-wide dsRNA library</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plates, black with clear bottom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>6569</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denville</td>
<td>B1212-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Well Mate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matrix</td>
<td>201-10001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 pin manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B2261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescently-labeled secondary antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageXpressMicro automated microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MetaXpress image analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells

だけでなく、ウイルスは、ヒトの病気の自然な流行を引き起こす可能性がありますが、バイオテロの潜在的な利用も懸念される。ウイルス性病原体は、重大な公衆衛生上の脅威を表す。衝撃の感染が待望の治療薬の開発を促進することを細胞因子の理解を深める。いくつかの生物の塩基配列の完全なゲノムとの結合RNA干渉（RNAi）技術の最近の進歩により、ゲノムワイドな、セルベースの機能喪失の画面の最適化につながっている。 ショウジョウバエの細胞ためのゲノムスケールの画面には特に敏感に反応このシステム1におけるRNAiの使いやすさと効率性。重要なのは、ウイルスの多種多様な医療や農業の大切さ2,3,4の哺乳類のウイルスの数を含む、 ショウジョウバエの細胞を、感染することができます。 ショウジョウバエの前のRNAiスクリーニングは、エントリ、翻訳とRNA複製5を含むウイルス感染におけるさまざまなステップに必要な宿主因子を同定した。また、 ショウジョウバエの細胞培養でウイルス複製に必要な細胞因子の多くは、これらのウイルス4,6,7,8、9に感染したヒトの細胞に制限されています。したがって、ウイルス感染時の共存を選んだ宿主因子の同定は、抗ウイルス治療のための新しいターゲットを示します。ここでは例として、 ワクシニアウイルスを使用して、ウイルス感染に関与する細胞因子を特定するハイスループットRNAiスクリーニングのための一般的なプロトコルを提示する。

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。 A<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細胞培養モデルでは、RNAi実験の容易さと効率のためにこのアプローチに特に適している。ここでは、使用してこのテクニックを示しています<em&gt;ワク</em例として&gt;ウイルス。

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

9.4K ビュー.  University of Pennsylvania. ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。 Aショウジョウバエ細胞培養モデルでは、RNAi実験の容易さと効率のためにこのアプローチに特に適している。ここでは、使用してこのテクニックを示していますワクウイルス。

ビデオ: RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

免疫・感染学

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワクウイルス感染ショウジョウバエセル