המחברים מבקשים להודות קרוז סטיבן עבור נוגדן dysfusion cDNA, פרע וזבובים 1118 W.

1. העובר אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת כלובים של 25 ° C באמצעות 2-4 בן יומו w 1118 מיץ צלחות flies.Grape משתנים בכל שעה במהלך היום כדי לסנכרן את איסוף ביצים במשך 1-2 ימים לפני איסוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים 1 שעות במהירות של 25 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה מלבנית של אגר מיץ ענבים, לחתוך קלות בסכין גילוח באמצע, לעזוב את קו אגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מכשיר מתכת העברת עוברים מהצלחת מיץ ענבים ליצירה שלך אגר מיץ ענבים, קו אותם בקו ישר עם ציר זמן של העובר בזווית של 45 מעלות לקו באמצע אגר. קבל קו ישר של כ 50 עוברים. ודא שכל נקודה עוברים באותו כיוון, עם קצה אחורי הצבעה מן השורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה מלבנית של נייר מקל כפול, ולמקם אותו להחליק כיסוי 18x18mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי עוברים עם קלטת מקל כפולה על להחליק את מכסה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כיסוי להחליק להחליק כוס, יבש העובר באוויר במשך 10 דקות בערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העובר בשכבה דקה של שמן 700 Halocarbon, עכשיו זה מוכן להזרקה. </li></ol> 2. משיכת המחט הפוך את המחטים microinjection ידי משיכת צינורות זכוכית נימי. אנו משתמשים חולץ מחט מן העולם Precision Instrument (דגם PUL-1). חולץ מחט מפרטי התוכנית הם: חום: 1, עיכוב 4. 3. מילוי מחטים חזור עומס מחטים באמצעות P20 Eppendorf פיפטה מצויד טיפים Eppendorf Microloader, בדרך כלל עומס 1.5-2 dsRNA μL 4. שוברים את מחטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שבירת מחט, במקום coverslip לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית עם טיפה של שמן באמצע השקופית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את השלישי Picospritzer picopump להתאים את לחץ האוויר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את המחט מלא על קצה להחליק כיסוי, יצירת נקודה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצה שבור, צעד על דוושת הרגל של Picospritzer III picopump, dsRNA כמה ידלפו מתוך קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השקופית עם coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט תחת טיפת שמן באמצע השקופית מוכן לפני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדרה על III Picospritzer picopump לקבל 100-200pl dsRNA כאשר צעד על דוושת רגל. dsRNA ניתן לראות טיפה קטנה. </li></ol> 5. הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את קצה המחט לחלק האחורי של העובר blastoderm הראשון לתוך המטוס מוקד ואותו מזריקים את העובר מחוץ למרכז סביב אורך 30-50 ביצה%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הרגל על ​​דוושת של III Picospritzer picopump, כמות קטנה של dsRNA יופיע כנקודה קטנה הזריקה. </li></ol> 6. פנוטיפי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, במקום להחליק לתוך תא לחה מכוסה (פלסטיק צלחת פטרי) בשעה 18 ° C עד העוברים להתפתח לשלב העוברי הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדיקה כדי להסיר עוברים מהקלטת דו צדדי ולדחוק אותם אל קצה להחליק את המכסה. שטפו את העוברים את השקופית לתוך בקבוקון אוסף עם רשת ניילון בתחתית באמצעות heptane, לשטוף 3 פעמים עם PBT. עוברים Dechorionate ב אקונומיקה 50% עבור 5 דקות, לשטוף 3 פעמים עם PBT. העברת עוברים מבקבוקון את האוסף פיסת רשת ניילון, ולאחר מכן טובלים את רשת ניילון לתוך הפתרון מקבע (heptane 5 מ&quot;ל, 4.5ml PBS, פורמלדהיד 0.5ml 37%) לשחרר את העוברים. תקן עוברים בפתרון מקבע עבור 30 דקות. Devitellinize עוברים עם מתנול, העברת עוברים אל צינור Eppendorf, ו immunostain את העוברים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים יכול גם להתפתח בשלב הזחל המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית עם טיפה של שמן Halocarbon 700 באמצע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד הזחלים לשקופית, לשים פתק לכסות על הדף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב הזחלים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. </li></ol> 7. נציג תוצאות: דוגמה dsRNA להפיל (פרע) dysfusion הגן בעובר Drosophlia מוצג Fig1. GFP-dsRNA מוזרק הם עוברים בקרת שלילית. פרע הוא גורם שעתוק PAS bHLH לידי ביטוי בתאים היתוך קנה הנשימה. GFP-dsRNA עוברים מוזרק להראות היתוך קנה הנשימה נורמלי, חלבון פרע קיים בתאים היתוך (איור 1A). מצד שני, פרע dsRNA מוזרק עוברים להראות פיוז&#39;ן בסניף נכשל, חלבונים פרע לא נמצאים בתאים היתוך (איור 1B). כאשר הזריקו dsRNA העוברים להתפתח בשלב הזחל, הזחלים פרע dsRNA מוזרק הראה היתוך סניף נכשל (Fig.1D) לעומת שליטה GFP-dsRNA שלילי מוזרק (תרשים 1C). תוצאות אלה הראו יעיל להפיל הביטוי פרע אנדוגני הגן על ידי dsRNA הזרקת לעוברי תסיסנית <img src="/files/ftp_upload/2477/2477fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הסרה של הפונקציה על ידי פרע פרע RNAi מגלה היתוך ד קנה הנשימהefects. עוברים Blastoderm (w 1118) הוזרקו או GFP-dsRNA (שליטה שלילי) או פרע dsRNA ו assayed פגמים קנה הנשימה. (א) 16 עובר שלב מוזרק עם GFP-dsRNA ומוכתמת עם α-פרע ו מב 2A12 כי כתמים לומן קנה הנשימה. בולט הוא הראה את תא המטען לרוחב, אשר התמזגו. הצבע על חצים לרוחב פרע חיובי תאים גזע היתוך. (ב) 16 עובר שלב מוזרק עם פרע dsRNA ומוכתמת עם α-פרע ו מב 2A12. העובר הראה חוסר איחוי תא המטען לרוחב (כוכבית מציינת את המיקום הרגיל של היתוך המטען לרוחב-בעוברים שליטה). פרע חיובי לא נצפו תאים, המעיד כי פרע RNA ביעילות בוטל חלבון פרע. (C ל-D) שניה instar הזחלים גם עם ה-GFP-dsRNA או פרע dsRNA נבדקו על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר פגמים קנה הנשימה. (ג) אתרים של היתוך מסומנים על ידי כוכבית ב-GFP הזחלים dsRNA לשלוט מוזרק. (ד) בתא המטען לרוחב לא הפתיל של הזחלים פרע RNA המוזרק, (*) מציין את המיקום הרגיל של היתוך גזע לרוחב.

<ol>
	<li>St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo.">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-219 (1992).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+gene+manipulation+in+Drosophila+melanogaster.">Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway.">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li><li>Misquitta, L., Paterson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+gene+function+in+Drosophila+by+RNA+interference+(RNA-i):+a+role+for+nautilus+in+embryonic+somatic+muscle+formation.">Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).</li><li>Horowitz, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+morphogenesis.">Branching morphogenesis.</a> Circ. Res. 103, 784-795 (2008).</li><li>Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis:+molecular+mechanisms+of+tubulogenesis.">Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).</li><li>Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system.">Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).</li><li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfusion+transcriptional+control+of+Drosophila+tracheal+migration,+adhesion,+and+fusion.">Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).</li><li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+dysfusion+basic+helix-loop-helix+(bHLH)-PAS+gene+controls+tracheal+fusion+and+levels+of+the+trachealess+bHLH-PAS+protein.">The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

נוכח שיטת הזרקה dsRNA כאן מאפשר ניתוח רגיש מאוד מהיר של תפקוד הגן בהתפתחות תסיסנית קנה הנשימה. שיטה זו עלולה להיות מיושם לנתח תפקוד הגן רקמות אחרות ופיתוח איברים.

<table><tbody><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III picopump</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21170M</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr></tbody></table>

rnai interference by dsrna injection into drosophila embryos

בדיקה גנטית היא אחת השיטות החזקות ביותר עבור השגת תובנות לתוך תהליך ביולוגיות מורכבות 1. במהלך השנים שיפורים רבים וכלים מניפולציה גנטית הפכו זמינים תסיסנית 2. זמן קצר לאחר הגילוי הראשוני על ידי Frie מלו ו 3 כי RNA גדילי כפול ניתן להשתמש מציאה את פעילותם של גנים בודדים Caenorhabditis elegans, התערבות RNA (RNAi) הוצגה כדי לספק גישה חזקה גנטית הפוכה לנתח פונקציות הגן בהתפתחות איבר תסיסנית 4, 5. איברים רבים, כולל ריאות, כליות, כבד, מערכת כלי הדם, מורכבים ברשתות צינורי מסועפת תחבורה חיוני נוזלים או גזים 6, 7. ניתוח של היווצרות תסיסנית קנה הנשימה מספקת מערכת מודל מצוינת ללמוד את המורפוגנזה של איברים אחרים צינורי 8. תסיסנית ברקלי פרויקט הגנום חשף מאות הגנים באים לידי ביטוי במערכת קנה הנשימה. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי ו הסלולר של היווצרות צינור, האתגר הוא להבין את התפקידים של גנים אלה בהתפתחות קנה הנשימה. כאן, אנו תיאר שיטה מפורטת של dsRNA זריקה לתוך העובר תסיסנית כדי ביטוי גנים בודדים מציאה. אנחנו בהצלחה הפילו dysfusion אנדוגני (פרע) ביטוי גנים באמצעות זריקה dsRNA. פרע הוא חלבון bHLH-PAS לידי ביטוי בתאים היתוך קנה הנשימה, והוא נדרש ענף היתוך קנה הנשימה 9, 10. פרע RNAi בוטלו לחלוטין הביטוי פרע וגרם פגם היתוך קנה הנשימה. שיטה זו פשוטה יחסית מספקת כלי לזיהוי גנים requried עבור tissure ופיתוח איבר תסיסנית.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos at JoVE.com

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד הגן<em&gt; תסיסנית</em&gt; פיתוח קנה הנשימה. פרוטוקול מפורט בשימוש על ידי ג&#39;יאנג במעבדה להזריק dsRNA לעוברי לטוס ביטוי גנים מציאה מודגם. טכניקה זו יש פוטנציאל ההקרנה גנים הדרושים להתפתחות רקמות איבר<em&gt; תסיסנית</em&gt;.

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

rnai-interference-by-dsrna-injection-into-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

16.1K Views.  Oakland University. התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד הגן תסיסנית פיתוח קנה הנשימה. פרוטוקול מפורט בשימוש על ידי ג'יאנג במעבדה להזריק dsRNA לעוברי לטוס ביטוי גנים מציאה מודגם. טכניקה זו יש פוטנציאל ההקרנה גנים הדרושים להתפתחות רקמות איבר תסיסנית.

Video: RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genetics

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Environment

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Neuroscience

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully annotated genome sequence, transposon-based transgenesis, and effective RNA interference (RNAi). Among these advantages, RNAi-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. T. castaneum show a robust systemic RNAi response, making it possible to perform RNAi at any life stage by simply injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the beetle&#8217;s body cavity.
In this report, we provide an overview of our larval RNAi technique in T. castaneum. The protocol includes (i) isolation of the proper stage of T. castaneum larvae for injection, (ii) preparation for the injection setting, and (iii) dsRNA injection. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides us with quick access to loss-of-function phenotypes, including multiple gene knockdown phenotypes as well as a series of hypomorphic phenotypes. Since virtually all T. castaneum tissues are susceptible to extracellular dsRNA, the larval RNAi technique allows researchers to study a wide variety of tissues in diverse contexts, including the genetic basis of organismal responses to the outside environment. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making T. castaneum an ideal genetic system for use in a classroom setting.

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi)-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. Here, we provide an overview of our larval RNAi technique in Tribolium castaneum. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides quick access to loss-of-function phenotypes, allowing researchers to study gene functions in diverse contexts.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית,

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

RNAi טריגר משלוח לתוך

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

RNAi in C. elegans