המחברים מודים על התמיכה הכספית של עבודה זו על ידי המוסד האמריקני למדע תחת גרנט מס &#39;0719232, על ידי משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (DEFG02-01ER15129), ועל ידי פרוטאה Biosciences, Inc (Morgantown, WV). המחברים רוצה גם להודות ג&#39;סיקה א Stolee על עזרתה במהלך במצלמת וידיאו את הפרוטוקול.

הפרוטוקול שלהלן מתארת ​​את השלבים העיקריים של יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ניסוי ומספק דוגמאות מייצגות עבור דימות (3D) בצירי תלת ממדי עבור בעלי חיים דגימות רקמות הצמח. פרטים ניסיוניים טכני נוסף ניתן לקבל במקום אחר. 1-6 1. רקמות הכנה הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חתך נדרש, השתמש cryomicrotome סעיף הרקמה לתוך 1-10 פרוסות עבות מיקרומטר ב -10 עד -20 ° C אלא אם מומלץ אחרת לסוג רקמה מסוימת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חלקים על גבי משטח שטוח (למשל, ניקוי כימי קדם שקופיות זכוכית) ישירות ללא מכפילי כימיים. עבור רקמות מחולק, להפשיר-Mount בסעיפים ומאובטח בעל מדגם לשלב Peltier קירור מיד עם ההפשרה הרכבה כדי לשמור על הרקמה הקפואה בכל עת במהלך ניתוח. צעד זה נחוץ כדי למזער / למנוע הגירה מולקולרית בסעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להשתמש מפזר החום מצויד מאוורר צריכת חשמל נמוכה כדי להקל על הסרת חום מהשלב-Peltier כדי לשמור על הרקמה הקפואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה לחה על פני תקופה ממושכת של זמן (1-2 שעות), לבדוק את התעבות של מים או קרח על פני השטח רקמות. עיבוי מים על הרקמה לרעה משפיע על הביצועים הדמיה בניסויים LAESI 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להשתמש במסיר לחות בחדר או במקום מקורר מדגם בתא סביבתי מלא גז אינרטי (גז למשל, חנקן יבש) כדי למנוע התעבות. 1 </li></ol> 2. אופטימיזציה של מקור יון LAESI מקור יון LAESI מורכב לייזר אמצע אינפרא אדום, סדרה של אלמנטים אופטיים עבור היגוי אור ומיקוד כמו גם מחזיקי מדגם נוסף, רכיבי קירור, בשלבי תרגום, מערכת המסירה ממס. איור 1 מדגים את הסדר אופייני של רכיבים אלה ביחס לכניסה של מקור הלחץ האטמוספרי, יון של ספקטרומטר מסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמודגם באיור 1, העמדה מ&quot;מ מדגם 15-20 להלן פתח של קונוס ספקטרומטר מסה דגימה (ד OR-FP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Operate לייזר אמצע IR באורך גל 2.94 מיקרומטר ו 10 הרץ שיעור החזרה. להחליש את פלט לייזר אנרגיה ~ μJ / דופק 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשילוב של מראות זהב עדשה תוך התמקדות שקוף על אורך גל לייזר (למשל, Plano-קמור קפה 2 או ZnSe העדשה) לזוג הדופק לייזר אנרגיה לתוך המדגם על שכיחות נורמלי (ראה זווית שכיחות נכון לגבי השטח מדגם באיור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את אמצע אינפרא אדום ציר הקורה 5-8 מ&quot;מ מול פתח של קונוס ספקטרומטר מסה הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מיקום העדשה למקד את האנרגיה ואת הדופק של קרן הלייזר כדי להשיג את הסרת רקמת במקום מוקד. מידות נפח ablated לקבוע את פיקסל (או voxel הדמיה תלת ממדי) בגודל של היישום הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום פולט nanospray בקו אחד עם ציר כניסה של ספקטרומטר מסה במרחק פתח אל פולט קצה ~ 10 מ&quot;מ (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electrospray, להכין פתרון מתנול 50% עם חומצה אצטית 0.1% או 0.1% אמוניום אצטט תוסף עבור מצב יון חיובי או שלילי, בהתאמה. בהתאם המדגם, ממסים אורגניים אחרים, כגון אצטוניטריל, isopropanol וכו &#39;, ניתן להחליף מתנול בריכוזים המתאימים למשימה אנליטית. יציבות electrospray הוא קריטי עבור הדמיה מוצלחת. בהתאם לבחירת ממס, את קצב הזרימה ואת מתח הריסוס צריך להיות מותאם על מנת להשיג תרסיס יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תגובתי LAESI 6 יישומי הדמיה, הפתרון electrosprayed עשוי להכיל המגיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבת מזרק כדי לספק את הפתרון electrospray דרך פולט electrospray בקצב הזרימה של ~ 300 NL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פתח ספקטרומטר מסה הוא שמר על מתח נמוך (&lt;500 V נמדד כנגד הקרקע), ליצור electrospray על ידי יישום מתח גבוה ישירות פולט electrospray (למשל, 3000 V) או באמצעות איגוד מתכת. אחרת, הקרקע ישירות את emitter electrospray או באמצעות איגוד מתכת להקים electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור electrospray ב סילון קונוס ריסוס במצב לדור יון היעילה ביותר על ידי LAESI. ההשפעה של משתנים הפועלים על מצבי ריסוס והשפעתם על ספקטרום המוני, ראה דיונים אחרים. 5,7,8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתאים את המרחקים היחסית של ההתקנה LAESI לבצע אופטימיזציה עבור תשואה יון LAESI תוך שמירה על קרן לייזר, את emitter ואת צירי פתח באותו המטוס. בבקשה למצוא הוראות מפורטות במקום אחר. 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מיקרוסקופ אופטי, לקבוע את ממדי רוחבית של המכתש אבלציה על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שלושה ממדי ניסויים LAESI הדמיה, לבצע אבלציה עם פולסים הפרט לקבוע את עומק voxel באמצעות, לדוגמה, את מצב Z-המחסנית מיקרוסקופיה אופטית. 3 </li></ol> 3. הדמיה מולקולרית ניתוח נתונים בניסוי הדמיה, דגימה הרקמה מועברת במישור המוקד של הלייזר בכיוונים X ו-Y עם גודל צעד גדול או שווה ל מימדי במקום אבלציה. ההחלטה מרחבית מוגבלת על ידי מיקוד של קרן לייזר האירוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שטח של עניין על פני השטח מדגם להשיג את (X, Y) הקואורדינטות של גבולות המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו אלגוריתם gridding (למשל, רשת אדפטיבית, הדמיה האזור הנבחר, ברשת מלבנית, תבנית ספירלה, Z סריקה וכו &#39;) שבה אל פני השטח מדגם סריקה עם נבחרת זמן להתעכב על כל פיקסל על השטח להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלב שלוש ציר תרגום תוכנה המסוגלת rastering המדגם לפי לרשת מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הזמן הכולל הנדרש עבור הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבת את רכישת נתונים מגבלה של זמן ספקטרומטר מסה. אם הדבר אינו אפשרי, להגדיר את רכישת נתונים בזמן גבול ערך מחושב זמן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור אמצע לייזר אינפרא אדום בשיעור החזרה נכונה כדי לייצר מספיק יחס אות לרעש בספקטרום המונית תוך זמן להתעכב ליד כל פיקסל לבצע ניסוי LAESI הדמיה לרוחב. עבור הדמיה מולקולרית 3D, השתמש לרכישת ספקטרום שיעור גבוה יותר מאשר שיעור החזרה למקור הלייזר בהצלחה המוני לנתח את היונים שנוצר בתוך הדופק לייזר יחיד. חכו האות להתחיל ליזום את רצף אבלציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור electrospray. ודא כי קיים פתרון מספיק בפעם מלא נדרש הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל START רכישת ספקטרום המונית, אבלציה אמצע IR לייזר, סריקה משטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר לרוץ הדמיה סיימה, להפסיק את סריקת השטח, lasing אמצע IR, ורכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבת את מקור הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מתח גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ספקטרומטר מסה למצב המתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את Peltier קירור האלקטרוניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור זרימת גז אינרטי אם נעשה שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי לתאם את הקואורדינטות המוחלט של פיקסלים לרוחב או הדמיה voxels בניתוח 3D עם ספקטרום המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את עוצמת האות יון ערך m / z שנבחר נגד מתאמת המוחלט של ניתוח כדי להשיג תמונות מולקולרית לרוחב ו 3D. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 2 נותן תוצאות נציג כמה סוגי רקמות הגדולות שיטות הדמיה. לוח מתאר מקרה של מקטע רקמה חיה כי הוקפאה במהלך הניסוי על מנת למנוע התייבשות. 1 בנוסף, המדגם נמצא בסביבה יבשה גז חנקן כדי למנוע אדי מים מן הסביבה עיבוי על פני השטח מדגם. סעיף 100 מיקרומטר בעובי העטרה במוח חולדה (Rattus norvegicus) היה הדמיה רוחבית עם LAESI. האזורים האנטומיים של המוח (ראה תמונה אופטי בלוח) מראים קורלציה טובה עם התמונה מולקולרית השיג עבור ה-PC plasmalogens (O-33: 3) ו / או PE (O-36: 3) עם m / z 728.559. לוח ב &#39;מראה את 3D הדמיה LAESI מפעל זברה (Aphelandra squarrosa) רקמת העלה. בגלל העלים בעלי מנגנון הגנה טבעי מפני התייבשות, המדגם יכול להיות נחקר בסביבה הסביבה. 3 התמונות שהתקבלו מולקולרית 3D חשף מגוון של דפוסי התפוצה של מטבוליטים ראשוניים ומשניים. בין היתר, acacetin עם m / z 285.076 זוהה על ספירת יון גבוה יותר במגזרים צהוב של שכבות השני והשלישי מלמעלה עם חלוקה הומוגנית של האחרים. התפלגות זו הסכים עם דפוס של ססגון לראות תמונה אופטי. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי של מערכת LAESI (ES, טיפ electrospray פולט, או, פתח חרוט ספקטרומטר מסה הדגימה, פלורידה, תוך התמקדות העדשה; FP, נקודת מוקד, P, בשלב Peltier הקירור; HS, מפזר החום). חלק מן החומר חלקיקי גורשו במהלך אבלציה אמצע IR (נקודות אדומות), מתמזגת עם electrospray להניב טיפות טעונה seeded עם מולקולות ויונים של המדגם (נקודות ירוקות). יוני שוחרר מבית טיפות אלה נותחו נרשמו על ידי ספקטרומטר מסה. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות עבור נציג Imagi לרוחב ו 3D. ng עם LAESI ספקטרומטריית מסה (A) הפאנל העליון מתאר את התמונה האופטי במוח חולדה (Rattus norvegicus) סעיף העטרה ואת התמונה מולקולרית השיג עבור ה-PC plasmalogens (O-33: 3) ו / או PE (O-36 : 3) עם m / z 728.559. סרגל סולם לבן מתאים מ&quot;מ 1. עיבוד באישור (Reference 1). כל הזכויות שמורות 2010 האגודה האמריקנית לכימיה. (ב) פאנל התחתונה מציגה הדמיה 3D של עלה מתוך מגוון זברה צמח (Aphelandra squarrosa). Acacetin עם m / z 285.076 זוהה על ספירת יון גבוה יותר במגזרים צהוב של שכבות השני והשלישי מלמעלה עם חלוקה הומוגנית של האחרים. התפרסם באישור (Reference 3). כל הזכויות שמורות 2009 האגודה האמריקנית לכימיה.

<ol>
	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

סוגי רקמות שונות התערוכה תוכן משתנה מים חוזק מתיחה, אשר, בתורם, יכולים להשפיע על מאפייני אבלציה של הדגימות. 9 כדי לצמצם את ההשפעות הללו, הוא הרצוי כי הפרוטוקולים השטף לייזר, טיפול מדגם, וניתוח להיות מתוקן כאשר משתנה בין רקמה סוגים עיקריים. עבור תא יחיד או חקירות רזולוציה גבוהה יותר, האור אמצע אינפרא אדום ניתן בשילוב לתוך סיב אופטי מחודד במקום העדשה מתמקדת. 10 מאת מיקום קצה סיב בתוך בסמיכות של התאים הנבחרים ברקמות, ניתוח LAESI יכול להתבצע על רמת מתחיל מתא בודד. כמקור-תווית חינם יון עבור ספקטרומטריית יינון הסביבה המונית, 11 LAESI הראו פוטנציאל גדול חקירה של תהליכים ביוכימיים ברקמות. עם היתרונות של ניתוח ישיר הוסיף, ההדמיה לרוחב ו 3D, LAESI הוא כלי bioanalytical המתעוררים פרופיל, כמו גם יישומי הדמיה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

שיטות יינון אמביינט ב ספקטרומטריית מסה לאפשר חקירות אנליטית להתבצע ישירות על רקמות או biofilm תחת הילידים כמו תנאי הניסוי. Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא אחד התפתחות כזו היא בעיקר מתאים היטב החקירה של מים המכילים דגימות. LAESI מנצל קרן אמצע לייזר אינפרא אדום (אורך גל 2.94 מיקרומטר) כדי להלהיב את מולקולות המים של המדגם. כאשר סף השטף אבלציה חריגה, החומר המדגם הוא גורש בצורה של חומר חלקיקי וקלעים אלה לנסוע עשרות מילימטרים מעל פני השטח מדגם. ב LAESI, פלומה זו אבלציה הוא יורט על ידי טיפות טעון ללכוד שבריר של החומר מדגם נפלט להמיר מרכיבים כימיים שלה לגז שלב יונים. ספקטרומטר מסה מצויד בממשק בלחץ אטמוספרי מקור יון מועסק לנתח ולתעד את ההרכב של יוני שוחרר שמקורם באזור נחקר (פיקסל) של המדגם. חקירה שיטתית על מערך של פיקסלים פותחת דרך הדמיה מולקולרית במצב ניתוח microprobe. היבט ייחודי של הדמיה המוני LAESI spectrometric הוא פרופיל עומק, בשילוב עם הדמיה לרוחב, מאפשר תלת ממדי (3D) הדמיה מולקולרית. עם החלטות לרוחב ועומק הנוכחי של ~ ~ 100 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר, בהתאמה, הדמיה LAESI מסה spectrometric מסייעת לחקור את המבנה המולקולרי של רקמות ביולוגיות. במסמך זה, נסקור את האלמנטים העיקריים של מערכת LAESI ולספק הנחיות ניסוי הדמיה מוצלחת.

Watch this Scientific Journal Video about Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry at JoVE.com

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא מקור של לחץ אטמוספרי יון עבור ספקטרומטריית מסה. במצב הדמיה, אמצע אינפרא אדום בדיקות הלייזר הפצות של מולקולות על פני קטע רקמה או biofilm. טכניקה זו מציגה גישה חדשה ללימודי bioanalytical מגוונים שבוצעו תחת תנאים ניסויים הילידים.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  George Washington University. Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא מקור של לחץ אטמוספרי יון עבור ספקטרומטריית מסה. במצב הדמיה, אמצע אינפרא אדום בדיקות הלייזר הפצות של מולקולות על פני קטע רקמה או biofilm. טכניקה זו מציגה גישה חדשה ללימודי bioanalytical מגוונים שבוצעו תחת תנאים ניסויים הילידים.

Video: Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...