עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר, המכונים הלאומיים לבריאות (K25HD097288, R21HD112663).

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וויין סטייט.
1. הכנה ניסיונית
<ol><li>השתמש בתמיסת אתנול 70% כדי לנקות ולעקר את המספריים והפינצטה. כמו כן, להכין פיפטות חד פעמיות מזרק.</li>
	<li>הכינו מדיום שטיפה על ידי הוספת 3.595 גרם של NaCl ל 495 מ"ל של מים נטולי יונים. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (5 U / mL) למדיום. ממלאים צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ במדיום הכביסה ומחממים אותה ל-37°C.</li>
	<li>הכינו מנות תרבות לפי איור 1, שממחיש את התצורה הכוללת.<ol><li>מכינים פיסת נייר פילטר, חותכים אותה לצורה מלבנית של כ-17 מ"מ ×-20 מ"מ, ומסירים את ארבע הפינות. צרו מרכז חלול בנייר הסינון, בגודל של כ-7 מ"מ ×-10 מ"מ לאבטחת העובר (איור 1, משמאל). הערה: אוסף העוברים מתואר בשלב 2.</li>
		<li>חבר טבעת זמינה מסחרית (Φ = 1 אינץ ', ראה טבלת חומרים) עם שכבת סרט גמישה (כלומר, סרט פרפין), כדי להבטיח שלסרט הגמיש יש גם מרכז חלול. טבעת זו עם הסרט תשמש להחזקת נייר הסינון עם העובר.</li>
		<li>לבסוף, הניחו את הטבעת המוכנה בתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ (איור 1, מימין). הערה: נייר הסינון נועד לאבטח ולהחזיק את העובר שחולץ על ידי הנחת נייר הסינון על הממברנה והשארת העובר באזור החלול המרכזי (שיפורט בשלב 2). ארבע הפינות נחתכו כך שיתאימו לגודל הטבעת החיצונית (אין צורך אם היא כבר מותאמת). צלחת תרבית בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ משמשת להתפשטות טובה יותר של קרן לייזר. למנה יש באר פנימית (Φ = 23 מ"מ), אותה ניתן למלא באלבומן לתרבות אקס אובו . קוטר הטבעת חייב להיות גדול יותר מקוטר הבאר הפנימית כדי שניתן יהיה לכסות את הבאר על-ידי הסרט הגמיש שעל הטבעת (איור 1, כניסה). גודל נייר הסינון אינו מוגבל וניתן לשנותו בהתאם לגודל הטבעת שנבחרה וצלחת התרבית. לחלופין, ניתן לצפות מראש את תחתית המנה בשכבת אגרוז (עובי: ~1 מ"מ). על ידי הסרת אגרוז ממרכז השכבה באמצעות להב, ניתן ליצור באר בעלת צורה דומה למרכז החלול של הסרט הגמיש לטעינת אלבומן. נקודה קריטית אחת היא שארבעת הצדדים של נייר הסינון החלול צריכים להיות ברוחב מספיק (> 5 מ"מ) כדי להבטיח את החיבור של העובר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מיצוי ותרבית אקס אובו של עובר התרנגולת
הערה: שלב זה שונה מדוחות40,41 שפורסמו בעבר.
<ol><li>לאחר טרום תרבית, שלפו את הביצה מהאינקובטור והניחו אותה על צירה הארוך על מגש קרטון הביצים. נקו את קליפת הביצה עם 70% אתנול, הקפידו לכסות את כל פני השטח ולאחר מכן אפשרו לה לנוח במשך 15 דקות.</li>
	<li>מחזיקים את הביצה על צירה הקצר ומפצחים אותה בתחתית. פתחו את הביצה מעל צלחת פטרי נקייה בקוטר 100 מ"מ כדי לחלץ את תכולתה, כפי שמודגם באיור 2. הקפידו לא לסובב את הביצה בזמן שאתם מחזיקים ומפצחים אותה.</li>
	<li>בעזרת פיפטה, מעבירים ואוספים כ-10 מ"ל מהאלבומן הדק (כלומר, האלבומןהנוזלי 42) לתוך צינור של 15 מ"ל לשימוש בתרבית אקס-אובו . מלאו את הבאר המרכזית של צלחת התרבית בחלבון הדק שנאסף (כ-0.9 מ"ל), כפי שמוצג באיור 3. תהליך המילוי צריך להיות איטי, הימנעות היווצרות של כל בועות בתוך הבאר. ודא כי צלחת התרבות עם אלבומן הוא מחומם ל 37 °C (77 °F). הערה: מאכל זה ישמש לגידול העובר לשעבר. כלי תרבית חדשים מלאים במדיום שטיפה ישמשו במהלך הדמיה ברילואין (ראה שלב 3).</li>
	<li>בעזרת נייר טישו, הסירו בעדינות את האלבומן העבה (כלומר, האלבומן הצמיגי) המחובר לעובר על-ידי הפרדה זהירה של האלבומן מקרום הוויטליין, כפי שמודגם באיור 4. הימנע ממגע ישיר עם קרום ויטלין.</li>
	<li>לאחר הסרת כל האלבומן העבה, מדביקים בזהירות את נייר הסינון לקרום הוויטליין. ודא שציר הגוף של העובר מיושר עם הציר הארוך של המלבן המרכזי על נייר הסינון. השתמש במספריים כדי לחתוך את הקרום המקיף את נייר הסינון.</li>
	<li>בעזרת פינצטה, משכו בעדינות את נייר הסינון המבודד מהחלמון לכיוון אלכסוני. הפוך את נייר הסינון כדי למקם את העובר עם הצד הגבי שלו כלפי מטה (לתצורת מיקרוסקופ הפוך). טבלו בזהירות את כל נייר הסינון מצד אחד של הציר הארוך לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ עם מדיום הכביסה בצורה אלכסונית.</li>
	<li>שטפו את שאריות החלמון על ידי ריסוס עדין של אמצעי הכביסה במקביל לנייר הסינון באמצעות פיפטה נקייה. יש להימנע מריסוס ישיר של אמצעי השטיפה על הממברנה.</li>
	<li>לאחר ניקוי כל החלמון, הסר בזהירות את נייר הסינון ממדיום הכביסה והשתמש בנייר טישו כדי לספוג את עודפי המדיום מהקצוות. לאחר מכן, הניחו את נייר הסינון עם העובר על צלחת התרבית, וודאו שהצד הגבי של העובר פונה כלפי מטה, כפי שמודגם באיור 5. כדי לשמור על לחות, הניחו נייר טישו לח בצלחת.</li>
	<li>העבירו את מנת התרבות לחממה על הבמה לתרבות אקס אובו .</li>
</ol>3. מדידת ברילואין של העובר
<ol><li>הכינו סט נוסף של כלי תרבות ומלאו אותם במדיום שטיפה. יש לוודא שמדיום הכביסה מחומם ל-37°C.</li>
	<li>כאשר העובר מגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי, מעבירים את נייר הסינון עם העובר לצלחת התרבית המלאה במדיום שטיפה. הכניסו את מנת התרבית לחממה על הבמה של מיקרוסקופ ברילואין (ראו טבלת חומרים).<ol><li>לפני ביצוע מדידת Brillouin, שמור תמונת שדה בהיר של העובר כולו לעיון. התצורה המפורטת של מיקרוסקופ ברילואין תוארה בעבר30 והיא מסוכמת בסעיף התוצאות (איור 6).</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד את אות ברילואין של מים ומתנול, אשר ישמש בשלב 4 לתהליך הכיול.</li>
	<li>התאם את עוצמת הלייזר של האירוע ואת זמן החשיפה של המצלמה למכשיר מצמיד מטען מכפיל אלקטרונים (EMCCD, ראה טבלת חומרים) כדי להשיג לפחות 10,000 ספירות של אות ברילואן. השתמש בתמונת השדה הבהיר כקו מנחה, הגדר את טווח הסריקה ואת גודל המדרגה. לרכוש תמונה Brillouin של האזור של עניין על ידי סריקת העובר באמצעות שלב תרגום דו ממדי. הערה: ניתן לקבוע את טווח הסריקה האופקי בהתבסס על תמונת השדה הבהיר, וניתן לקבוע את טווח הסריקה האנכי (כלומר, העומק) בהתבסס על עוצמת האות המתקבלת מסריקה מהירה וגסה. כדי למנוע נזק לאור לעובר, הגבל את עוצמת האירוע ל- 25 mW והגדר את זמן החשיפה של מצלמת EMCCD ל- 50ms. בחר גודל צעד של 2 מיקרומטר בכיוון האופקי ו- 1 מיקרומטר בכיוון האנכי כדי לאזן את איכות ההדמיה ואת זמן הרכישה.</li>
	<li>לאחר השלמת הסריקה, הסר בזהירות את נייר הסינון עם העובר והשתמש בנייר טישו כדי לספוג את כל אמצעי הכביסה העודפים. לאחר מכן, החזירו את נייר הפילטר לצלחת התרבית המלאה באלבומן דק לטיפוח רציף באינקובטור שעל הבמה.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.2-3.5 במרווחי זמן קבועים (לדוגמה, 1.5 שעות) כדי לצלם תמונות ברילואין בהילוך מהיר עם התפתחות העובר.</li>
	<li>שחזר את תמונת Brillouin הדו-ממדית לאחר שלב 4.</li>
</ol>4. שחזור תמונה ברילואין
<ol><li>כייל את ספקטרומטר ברילואין באמצעות אותות ברילואין של מים ומתנול כדי לחשב את הטווח הספקטרלי החופשי (FSR) ואת יחס ההמרה בין פיקסל לתדר (PR) של הספקטרומטר30. הערכים המכוילים של FSR ו- PR ישמשו לחישוב הסטת ברילואין של העובר בכל פיקסל. הערה: איור 7A מציג ספקטרום ברילואין גולמי שנלכד על-ידי מצלמת EMCCD. על-ידי סיכום אנכי של הספקטרום ולאחר מכן ביצוע התאמה לורנציאנית, ניתן לקבל את מרחק השיא Δd של שתי הנקודות (איור 7B). על ידי קבלת מרחק השיא של מים Δdמים ומתנול Δdמתנול, FSR ו- PR ניתן לחשב על בסיס משוואות30: PR = 2· (ωמתנול-ω מים)/(Δd מים- Δdמתנול), ו-FSR = 2·ωמים + PR·Δdמים, עם הסטת ברילואין ידועה של מים ωמים = 6.01 GHz ומתנול ωמתנול = 4.49 GHz ב-660 ננומטר.</li>
	<li>קבל את מרחק השיא של אות Brillouin בכל פיקסל של הדגימה. חשב את הסטת ברילואין בהתבסס על FSR ו- PR מכוילים:ω sample = 0.5 (FSR - PR x Δdsample)30, כאשרω sample הוא הזזה Brillouin של הדגימה,ומדגם Δd הוא מרחק השיא של אות Brillouin.</li>
	<li>בנה מחדש את תמונת Brillouin הדו-ממדית בהתבסס על הזזות Brillouin של כל הפיקסלים. הערה: כדי לבצע אנליזה מקומית, ניתן לבחור אזור עניין (למשל, הלוח העצבי) מתמונת ברילואין שנרכשה ולכמת את תכונותיה המכניות. גישה נפוצה היא לחשב את השינוי הממוצע Brillouin של האזור שנבחר.</li>
</ol>

ניטור אורכי של מכניקת הלוחות העצביים בהתפתחות עוברי אפרוחים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

ההתפתחות המוקדמת של העובר יכולה להיות מושפעת בקלות מהפרעות חיצוניות. לכן, נדרשת זהירות מרבית במהלך שאיבת הדגימה והעברתה. בעיה פוטנציאלית אחת היא ניתוק העובר מנייר הפילטר, מה שעלול להוביל להתכווצות קרום הוויטלין ולגרום לממצא מוטה של הצלחת העצבית בדימות ברילואין. יתר על כן, התכווצות זו עלו?...

מומים בתעלה העצבית (NTDs) הם מומים מולדים חמורים של מערכת העצבים המרכזית הנגרמים על ידי כשלים בסגירת הצינור העצבי (NTC) במהלך ההתפתחות העוברית1. האטיולוגיה של NTDs מורכבת. מחקרים הראו כי NTC כרוך ברצף של תהליכים מורפוגנטיים, כולל הרחבה מתכנסת, כיפוף של הלוח העצבי (למשל, התכווצות אפית), העלאת הקפל העצבי, ולבסוף היצמדות של הקפל העצבי. תהליכים אלה מוסדרים על ידי מנגנונים מולקולריים וגנטיים מרובים 2,3, וכל תקלה בתהליכים אלה עלולה לגרום NTDs 4,5,6. ככל שהראיות המצטברות מצביעות על כך שרמזים מכניים ממלאים תפקידים מכריעים גם במהלך NTC 3,7,8,9,10,11, ונמצאו קשרים בין גנים ורמזים מכניים 12,13,14, זה הופך להיות הכרחי לחקור את הביומכניקה של הרקמה במהלך הנוירולציה.
מספר טכניקות פותחו למדידת התכונות המכניות של רקמות עובריות, כולל אבלציה בלייזר (LA)15, דיסקציה והרפיה של רקמות (TDR)16,17, שאיפת מיקרופיפטה (MA)18, ננו-הזחה19 מבוססת מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מיקרו-כניסות (MI) ומיקרו-צלחות (MP)20, מיקרו-ריאולוגיה (MR) עם פינצטה אופטית/מגנטית 21,22,23וחיישנים מבוססי טיפות24., שיטות קיימות יכולות למדוד תכונות מכניות ברזולוציות מרחביות החל מקשקשים תת-תאיים ועד קשקשים רקמתיים. עם זאת, רוב השיטות הללו הן פולשניות מכיוון שהן דורשות מגע עם הדגימה (למשל, MA, AFM, MI ו- MP), הזרקת חומר חיצוני (למשל, MR וחיישנים מבוססי טיפות), או דיסקציה של רקמות (למשל, LA ו- TDR). כתוצאה מכך, זה מאתגר עבור שיטות קיימות כדי לפקח על האבולוציה המכנית של רקמת צלחת עצבית באתרו25. לאחרונה, אלסטוגרפיה של קוהרנטיות אופטית מהדהדת הראתה הבטחה למיפוי מכני ללא מגע ברזולוציה מרחבית גבוהה26.
מיקרוסקופ ברילואין קונפוקלי הוא שיטה אופטית מתפתחת המאפשרת כימות ללא מגע של ביומכניקה של רקמות ברזולוציה תת-תאית 27,28,29,30. מיקרוסקופ ברילואין מבוסס על עקרון פיזור האור הספונטני, שהוא האינטראקציה בין אור הלייזר המאורע לבין הגל האקוסטי הנגרם על ידי תנודות תרמיות בתוך החומר. כתוצאה מכך, האור המפוזר חווה שינוי תדר, המכונה הסטת ברילואין ωR, בעקבות משוואה31:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
כאן, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;"> הוא מקדם השבירה של החומר, λ הוא אורך הגל של אור האירוע, M הוא המודולוס האורכי, ρ הוא צפיפות המסה, ו-θ היא הזווית בין אור האירוע לאור המפוזר. עבור אותו סוג של חומרים ביולוגיים, היחס בין מקדם השבירה לצפיפות <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;"> הוא קבוע בקירוב 28,32,33,34,35,36. לפיכך, ניתן להשתמש ישירות בשינוי ברילואין כדי להעריך שינויים מכניים יחסיים בתהליכים פיזיולוגיים. ההיתכנות של מיקרוסקופ ברילואין אומתה בדגימות ביולוגיות שונות 29,37,38. לאחרונה הודגמה הדמיה מכנית בהילוך מהיר של עובר אפרוח חי על ידי שילוב של מיקרוסקופ ברילואין עם מערכת דגירה על הבמה39. פרוטוקול זה מספק תיאורים מפורטים של הכנת דגימה, יישום ניסוי ועיבוד וניתוח נתונים לאחר מכן. אנו מקווים שמאמץ זה יאפשר אימוץ נרחב של טכנולוגיית ברילואין ללא מגע לחקר רגולציה ביומכנית בהתפתחות עוברים ומומים מולדים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D motorized stage&#160;</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillouin Microscope with on-stage incubator</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken eggs</td>
			<td>University of Connecticut</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CS2100M-USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>#2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for in ovo culture</td>
			<td>GQF Manufacturing Company Inc.&#160;</td>
			<td>GQF 1502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>Oko labs</td>
			<td>OKO-H301-PRIOR-H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Artman instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3pc Micro Scissors 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>DR Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microdissection Forceps Set&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo

סגירת צינור עצבי (NTC) היא תהליך קריטי במהלך ההתפתחות העוברית. כישלון בתהליך זה עלול להוביל למומים בתעלה העצבית, ולגרום למומים מולדים או אפילו לתמותה. NTC כוללת סדרה של מנגנונים ברמה גנטית, מולקולרית ומכנית. בעוד רגולציה מכנית הפכה לנושא אטרקטיבי יותר ויותר בשנים האחרונות, היא נותרה במידה רבה לא נחקרת בשל היעדר טכנולוגיה מתאימה לביצוע בדיקות מכניות של רקמות עובריות תלת ממדיות באתרן. בתגובה, פיתחנו פרוטוקול לכימות התכונות המכניות של רקמה עוברית של תרנגולת באופן לא מגע ולא פולשני. זה מושג על ידי שילוב מיקרוסקופ Brillouin קונפוקלי עם מערכת דגירה על הבמה. כדי לחקור את מכניקת הרקמות, עובר טרום תרבית נאסף ומועבר לאינקובטור על הבמה לתרבית אקס אובו . במקביל, התמונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית נרכשות על ידי מיקרוסקופ ברילואין בנקודות זמן שונות במהלך הפיתוח. פרוטוקול זה כולל תיאורים מפורטים של הכנת דגימות, יישום ניסויים במיקרוסקופ ברילואין, ונתונים לאחר עיבוד וניתוח. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור את האבולוציה המכנית של רקמה עוברית במהלך ההתפתחות לאורך זמן.

Neural tube defects (NTDs) are severe birth defects of the central nervous system caused by failures in neural tube closure (NTC) during embryonic development1. The etiology of NTDs is complex. Studies have shown that NTC involves a sequence of morphogenetic processes, including convergent extension, bending of the neural plate (e.g., apical constriction), elevating the neural fold, and finally adhesion of the neural fold. These processes are regulated by multiple molecular and genetic mechanisms2,3, and any malfunction in these processes may result in NTDs4,5,6. As mounting evidence suggests that mechanical cues also play crucial roles during NTC3,7,8,9,10,11, and relationships have been found between genes and mechanical cues12,13,14, it becomes imperative to investigate the tissue biomechanics during neurulation.
Several techniques have been developed for measuring the mechanical properties of embryonic tissues, including laser ablation (LA)15, tissue dissection and relaxation (TDR)16,17, micropipette aspiration (MA)18, Atomic Force Microscopy (AFM)-based nanoindentation19, microindenters (MI)&#160;and microplates (MP)20, micro rheology (MR) with optical/magnetic tweezers21,22,23, and droplet-based sensors24. Existing methods can measure mechanical properties at spatial resolutions ranging from subcellular to tissue scales. However, most of these methods are invasive because they require contact with the sample (e.g., MA, AFM, MI, and MP), external material injection (e.g., MR and droplet-based sensors), or tissue dissection (e.g., LA and TDR). As a result, it is challenging for existing methods to monitor the mechanical evolution of neural plate tissue in situ25. Recently, reverberant optical coherence elastography has shown promise for non-contact mechanical mapping with high spatial resolution26.
Confocal Brillouin microscopy is an emerging optical modality that enables non-contact quantification of tissue biomechanics with subcellular resolution27,28,29,30. Brillouin microscopy is based on the principle of spontaneous Brillouin light scattering, which is the interaction between the incident laser light and the acoustic wave induced by thermal fluctuations within the material. Consequently, the scattered light experiences a frequency shift, known as the Brillouin shift &#969;R, following the equation31:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (1)
Here, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;" /> is the refractive index of the material,&#160;&#955; is the wavelength of the incident light, M&#39; is the longitudinal modulus, &#961; is the mass density, and &#952; is the angle between the incident light and the scattered light. For the same type of biological materials, the ratio of refractive index and density <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;" /> is approximately constant28,32,33,34,35,36. Thus, the Brillouin shift can be directly used to estimate relative mechanical changes in physiological processes. The feasibility of Brillouin microscopy has been validated in various biological samples29,37,38. Recently, time-lapse mechanical imaging of a live chick embryo was demonstrated by combining a Brillouin microscope with an on-stage incubation system39. This protocol provides detailed descriptions of sample preparation, experiment implementation, and data post-processing and analysis. We hope this effort will facilitate the widespread adoption of non-contact Brillouin technology for studying biomechanical regulation in embryo development and birth defects.

מחבר זרקור: מדידה ללא מגע של מכניקת רקמות בעוברי אפרוחים חיים באמצעות מיקרוסקופ ברילואין

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

The scope of this research is to develop a novel tool that can measure tissue mechanics of a live embryo. Using this tool, we want to understand how tissue mechanics evolves when the embryo is experiencing neuron tube closure. This can help us understand the mechanical regulations in embryonic development.To measure tissue stiffness, current methods such as atomic force microscopy, nanoidention, and micropipette aspiration need to contact sample physically and apply force to deform it. This is highly challenging for measuring tissue mechanics of live embryo in situ. Here, we employed an optical technology named Brillouin microscopy.Compared to other technologies, Brillouin microscopy only uses a focus beam to measure tissue mechanics. Thus, this is a non-contact and a noninvasive method and has some microspatial resolution. This allow us to capture time-lapse mechanical image of a live embryo in situ.In the future, we want to understand the role of tissue mechanics in embryonic development thoroughly. In specific, we want to study how genetic factors, biochemical signaling pathway, and tissue mechanics coordinate with each other in morphogenesis. This could provide us with new insight in the provision of birth disease such as neuron tube defects.

איור 6 מראה את הסכימה של מיקרוסקופ ברילואן. המערכת משתמשת בלייזר 660 ננומטר כמקור האור. מבודד ממוקם מיד אחרי ראש הלייזר כדי לדחות כל אור המוחזר לאחור, ומסנן צפיפות נייטרלית (ND) משמש לכוונון עוצמת הלייזר. זוג עדשות, L1 ו- L2, עם אורכי מוקד של f1 = 16 מ"מ ו- f2 = 100 מ"מ, בהתאמה, משמשות להרחבת...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo at JoVE.com

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

מטרת המחקר היא לפתח כלי חדשני שיכול למדוד את מכניקת הרקמה של עובר חי. באמצעות הכלי הזה אנו רוצים להבין כיצד מכניקת הרקמה מתפתחת כאשר העובר חווה סגירת צינור נוירון. זה יכול לעזור לנו להבין את התקנות המכניות בהתפתחות עוברית.כדי למדוד קשיחות רקמות, שיטות עכשוויות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי, ננו-זיהוי ושאיפה מיקרופיפטה צריכות ליצור קשר פיזי עם הדגימה ולהפעיל כוח כדי לעוות אותה. זה מאתגר מאוד למדידת מכניקת רקמות של עובר חי באתרו. כאן השתמשנו בטכנולוגיה אופטית בשם מיקרוסקופ ברילואן.בהשוואה לטכנולוגיות אחרות, מיקרוסקופ ברילואין משתמש רק באלומת מיקוד כדי למדוד את מכניקת הרקמות. לפיכך, זוהי שיטה ללא מגע ולא פולשנית ויש לה רזולוציה מיקרו-מרחבית כלשהי. זה מאפשר לנו ללכוד תמונה מכנית בהילוך מהיר של עובר חי באתרו.בעתיד, אנו רוצים להבין את תפקידה של מכניקת הרקמות בהתפתחות העוברית באופן יסודי. בפרט, אנו רוצים לחקור כיצד גורמים גנטיים, מסלול איתות ביוכימי ומכניקת רקמות מתואמים זה עם זה במורפוגנזה. זה יכול לספק לנו תובנה חדשה במתן מחלות לידה כגון מומים בצינור הנוירונים.

monitoring-mechanical-evolution-tissue-during-neural-tube-closure

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

530 Views.  Wayne State University. מטרת המחקר היא לפתח כלי חדשני שיכול למדוד את מכניקת הרקמה של עובר חי. באמצעות הכלי הזה אנו רוצים להבין כיצד מכניקת הרקמה מתפתחת כאשר העובר חווה סגירת צינור נוירון. זה יכול לעזור לנו להבין את התקנות המכניות בהתפתחות עוברית.כדי למדוד קשיחות רקמות, שיטות עכשוויות כגון מיקר...

Video: מחבר זרקור: מדידה ללא מגע של מכניקת רקמות בעוברי אפרוחים חיים באמצעות מיקרוסקופ ברילואין

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Experimental Preparation and Ex Ovo Culture of Chicken Embryo for Brillouin Microscopy

To begin, cut the filter paper into a rectangular shape of approximately 17 by 20 millimeters and remove the four corners. Then, create approximately seven by 10 millimeters of hollow center in the filter paper. Attach a commercially available ring to a flexible film layer and create a hollow center in the flexible film layer.Place a prepared ring into a 35-millimeter Petri dish. After pre-culturing, retrieve the egg from the incubator, and place it on its long axis on the egg carton tray. Clean the entire surface of the eggshell with 70%ethanol, and allow it to rest for 15 minutes.Hold the egg on its short axis and crack it at the bottom. Open the egg over a clean 100-millimeter Petri dish to extract its contents. Using a pipette, transfer approximately 10 milliliters of the thin albumin into a 15-milliliter tube for ex ovo culture.Fill the center well of the culture dish with thin albumin. Using tissue paper, gently remove the thick albumin attached to the vitelline membrane of the embryo. Now, carefully affix the filter paper to the vitelline membrane, ensuring the body axis of the embryo aligns with the center rectangle on the filter paper.Cut the membrane surrounding the filter paper with scissors. Using tweezers, gently pull the isolated filter paper away from the yoke in an oblique direction. Flip the filter paper upside down to position the embryo with its dorsal side down.Carefully immerse the entire filter paper from one side of the long axis into the 100-millimeter Petri dish containing wash medium. Using a clean pipette, gently spray the wash medium parallel to the filter paper to remove any residual yolk. Next, carefully remove the filter paper from the wash medium, and use tissue paper to absorb any excess medium from the edges of the embryo.Place the filter paper with the embryo onto the culture dish, ensuring that the dorsal side of the embryo is facing downward. Transfer the culture dish to the onstage incubator for ex ovo culture. Fill the culture dishes with a warm wash medium.When the embryo reaches a desired developmental stage, transfer the filter paper with the embryo to the culture dish filled with a wash medium. Place the culture dish into the onstage incubator of the Brillouin microscope. For the calibration process, measure the Brillouin signal of water.Then, measure the Brillouin signal of methanol. Under bright-field imaging with a four times objective lens, adjust the laser illumination point to the second pair of somites. Then, switch to a 40 times objective lens and perform fine adjustment of the laser point to the middle of the neural tube.Unblock the laser beam and adjust the focal plane. Scan the embryo using a two-dimensional translational stage and acquire a Brillouin image of the region of interest. After completing the scan, carefully remove the filter paper with the embryo.Use tissue paper to absorb any excess wash medium from the embryo. Place the embryo back into the culture dish filled with thin albumin for continuous culturing. For Brillouin image reconstruction, load the water and methanol signal data.Click set region and select the region with four dots for calculating calibration parameters. Save the calibration results. Load the embryo scanning data, and click start for the processing of the parameters.Finally, reconstruct the 2-D Brillouin image based on the Brillouin shifts of all pixels. Brillouin shift in the estimated longitudinal modulus of the neural plate against somite number and incubation time showed an increase in Brillouin shift of the tissue during neural tube closure.