שיטה זו תהיה בסיסית להבנת גסטרולציה לאורך היווצרות ביונקים. על ידי מתן אפשרות לניסויים בעוברים חיים בשלבים עובריים שהוסתרו זה מכבר בתוך הרחם האימהי. זה מאפשר, ממשיך צמיחה יעילה ומתאימה של עוברי עכבר מחוץ לרחם לתקופה ממושכת של עד 6 ימים.
ניתוח עובר מהיר והולם ו pregastrulation של ריכוז הגז ולחץ הם הצעדים הקריטיים ביותר לצמיחה מוצלחת של העובר. כדי להתחיל פולחן 7.5 יום או עוברי עכבר מתקדמים יותר, להפעיל את המסובב ואת יחידת החימום של מערכת החממה תרבות רולר לפחות 1 שעה לפני הניתוחים העובר. כמו כן, מוסיפים מי autoclave לבקבוק כניסת הגז ואת המבחנה שקע.
לאחר מכן, הפעל את מודול וסת הגז על ידי לחיצה על המתג הראשי, ולאחר מכן השתמש בבקרים המתאימים כדי להגדיר את ערכי החמצן והפחמן הדו חמצני ל -5% פתח את וסת הגז והזז את מתג המתח במשדר הלחץ כדי להגדיר את לחץ הגז לכ -6.5 עד 7 פאונד לאינץ 'מרובע. אשר את ערך לחץ הגז באמצעות מד לחץ דיגיטלי. נטר את זרימת הגז על ידי בדיקת קצב הבועות שנוצרו בתוך מבחנה מלאה במי מוצא שהוקצתה בתוך האינקובטור המדויק.
הגדר את קצב הבועה הנכון על ידי סגירה או פתיחה של שסתום זרימת הגז על מכסה בקבוק המים. ודא כי זרימת הגז מאפשרת היווצרות של בועות בקצב של 2 עד 4 בועות לשנייה או להגדיר את זרימת הבועה בנקודה הראשונה שבה מבעבע יוצא צינור שקע מלא מים. לאחר מכן, מלא את בקבוקי התרבות עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות.
השתמש ב bungs סיליקון חלול כדי לאטום את הבקבוקים ולחבר אותם לתוך התוף מסתובב חלול עבור שיווי משקל מראש במשך 1 שעה. שמור את החללים הריקים בתוף המסתובב אטום באמצעות bungs מוצק. לאחר מכן, לנתח את העוברים מעכבר בהריון מורדם.
נקו את הבטן עם 70% אתנול וחתכו את העור ואת דופן הבטן באמצעות מספריים. אתר קצה אחד של הרחם וחתוך בצומת בין השחלה לרחם. ממשיכים לחתוך לאורך הרחם עד לקצה השני ומעבירים לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב- DPBS.
לשטוף במהירות את המושגים ב- DPBS ולחתוך בזוגות כדי להקל על טיפול בעוברים. העבירו את כל זוגות המושגים למדיום ביתור מתואם מראש בצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ, ואז חתכו לתפיסות הבודדות. לאחר מכן, באמצעות זוג מלקחיים ברוטו, להסיר את דופן הרחם של המושגים על ידי קריעת רקמת הרחם, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים עדינים, מיקרוכירורגיים, לחתוך את הקצה של decidua בצורת אגס.
הכנס את המלקחיים ליד העובר במקביל לציר הארוך שלו ופתח את המלקחיים כדי לפצל את ההחלטה לחצי. לבסוף, באמצעות מלקחיים עדינים, לתפוס את העובר מן decidua ולקלף את שק החלמון הקודקודי את העובר, משאיר את חרוט אקטופלנטל שלם מחובר גליל הביצה. בחר את העוברים בלוח העצבי, או בשלב קיפול הראש המוקדם, שאינם מראים נזק באפילסט.
מעבירים 5 עד 6 עוברים נבחרים לבקבוק לבקבוקי תרבית הזכוכית המשתווים מראש ומניחים את הבקבוקים במערכת התרבות המסתובבת ב-37 מעלות צלזיוס, באטמוספירה של 5% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. כדי לתרבות טרום-סטרציה ועוברי גסטרולציה מוקדמים ולוחות סטטיים, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של מדיום תרבות עוברי הרחם לשעבר שהוכנו טריים לכל באר של צלחת 8 בארות. מניחים את הלוחות בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס עבור שיווי משקל מראש.
לאחר ניתוח העוברים מתוך הרחם כפי שהוכח בעבר, להעביר את העוברים בודדים לתוך כל באר של צלחת 8 היטב באמצעות פיפטה מיקרו ומניחים את הצלחת בתוך האינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. דמיינו את העוברים מתחת למיקרוסקופ סטריאו ובחרו לתרבות רק את אלה עם חלל מי השפיר שנוצר היטב ללא נזק ניכר וללא קרום הרייכרט. תנאי תרבות הרולר המתוארים בפרוטוקול זה עבור עוברים בני 7.5 יום תומכים בצמיחת עוברים קבועה ונורמלית עם יעילות ממוצעת של קרוב ל -75% לאחר 4 ימי תרבות.
היעילות של התפתחות העובר משתנה על פני רקעים גנטיים שונים של העכבר, אך היא חזקה באופן עקבי. תוספי עם HBS במקום HCS מניב יעילות של כ 68% לאחר 4 ימים של תרבות. הפיתוח של 6.5 עוברים ולוחות סטטיים הוא recapitulated כראוי עם יעילות של יותר מ 90% באמצעות מדיום תרבות עוברי הרחם לשעבר עם HCS ו- HBS.
תרבויות החל מעוברים מוקדמים מראות יעילות של 46% של התפתחות נכונה לשלב הסומיט המוקדם וכמעט 17% מהעוברים משלימים התפתחות נכונה לאחר 6 ימים של תרבות. מורפוגנזה ופיתוח רקמות להמשיך כראוי עד 42 somites. פגמים התפתחותיים מייצגים שנצפו בעוברים לתרבויות שיזמה מהיום העוברי 7.5, 6.5 ו-5.5 מוצגים כאן.
יש להשליך עוברים עם נזק קל לאפיבלסט או לעוברים השומרים על קרום הרייכרט. עוברים מוקדמים לא יגדלו כראוי או יציגו עיכובים התפתחותיים חמורים בעוד חיבור של האפיבלסט העוברי לפני השטח של הלוח יגרום לכישלון של התפתחות עוברית נוספת. החריגות העיקריות שנצפו בעוברים פגומים הן התפתחות האזור האחורי מחוץ לשק החלמון או פגמים בצמיחת הקפלים העצביים.
בתרבויות שפותחו מעוברים בני 5.5 יום נצפו לעתים קרובות פגם התפתחותי הוא נוכחות של אפיבלסט קטן ולא מפותח. באמצעות שיטה זו, החוקרים מסוגלים לבצע מגוון של מניפולציות פיזיות או כימיות בפיתוח עוברים לאחר מושתלים. לדוגמה, מניפולציה, השתלה תאית או מעקב שושלת.
שיטה זו לא רק סוללת את הדרך לחקר העכבר לאחר ההשתלה המתפתח בפירוט רב, אלא גם ליישום שיטות תרבות דומות בעוברים ממינים אחרים, כגון בני אדם.
