ברצוננו להודות מעבדה של א Hadjantonakis (סלואן קטרינג המכון) ואת המעבדה של ל Niswander (U קולורדו, דנבר) עבור עצות מועילות עם טכניקות לנתיחה ותרבות. עבודה זו נתמכה על ידי NRSA NS059562 כדי JDG ו RO1NS05897 כדי MER בשיתוף עם L. Niswander וג&#39; Nadeau (המכון Systems Biology).

1. הכנה של התקשורת בתרבות - כל ריאגנטים מפורטים בטבלה 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדה זכר הפשירי בסרום על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום להשבית בסרום חולדה במשך 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש צנטריפוגה בסרום ב 10K במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 50:50 supernatant ומערבבים עם פנול אדום חופשי DMEM w / גלוקוז גבוהות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מזרק אממ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות 1ml של התקשורת / העובר צריכים להיות מוכנים </li></ol> 2. בידוד של הרחם מן הסכר בהריון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נהלים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC), הסכר בהריון הוא הרדים הראשון הקריב מכן על ידי נקע בצוואר הרחם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הבטן עם EtOH 70% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורט נתיב קטן של העור לאורך קו האמצע, בדיוק מעל קו הפטמה, עם מלקחיים גדולים לפתוח את הבטן מתחת מלקחיים שלך עם מספריים גדולות. היזהר שלא כל נזק למבנה הפנימיs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים שלך לחתוך רוחבית מפתיחת הראשונית כלפי צד של העכבר כך את הבטן כולה פתוחה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיים רפידות שומן עודף יכול לעתים לטשטש את הרחם ואת אלה צריך להיות כך זז הצידה את החלק העליון של הרחם והשחלות ניתן לצפות בכל צד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבוט את החלק העליון של הרחם מתחת השחלות ולהשתמש מספריים שלך להפריד את הרחם מן השומן, חיתוך מקצה אחד של הרחם אל השחלה אחרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הרחם עם מלקחיים שלך במקום בצלחת פטרי עם תמיסת מלח </li></ol> 3. הסרת עוברים מן הרחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרחם עם מלח כדי להסיר כל דם עודף לקצץ כל עודפי השומן מבחוץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה צלחת נקייה עם טמפ &#39;החדר. תמיסת מלח כדי לשפר להדמיה Tyrodes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereomicroscope נפרד כל העובר או באמצעות מספריים קטנים, או אם יש צורך בסדר (# 5) מלקחיים בזהירות את קליפת הרחם מזה. </li> &lt;li&gt; הכנס מלקחיים עדין אל תוך החלל שבין קיר הרחם ואת decidua וקליפת בחזרה דופן הרחם, נזהרים שלא לנקב את העובר </li></ol> 4. הסרת decidua מעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט decidua כך את החלק כהה (השליה) פונה ממך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך עם מלקחיים שלך לאורך הקו המפריד בין החלק הכהה של decidua מחלק את המצית, נזהרים שלא לחתוך עמוק מדי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הפרדת השליה מהחלק העליון של שק החלמון, נזהרת שלא לקרוע את חרוט ectoplacental (EPC). בשלב זה אתה אמור להיות מסוגל לדמיין את קרום Reicherts על שק החלמון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להסיר את decidua כולה (חלק בהיר) נזהרים שלא לנקב את שק החלמון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קמצוץ ולהסיר את Reicherts ידי לקלף אותה הרחק EPC. אם EPC פגום או להפריד את שק החלמון, עוברים ייכשל לפנות בדרך כלל מ-E8.5 E9.5 </li><li&gt; עם Reicherts הוסר העובר צריך להיות גלוי בקלות דרך שק החלמון והוא יכול להיות מבוים על ידי somities הספירה. </li></ol> 5. הגדרת מערכת התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה של טפטפת העברת פלסטיק במספריים כדי להגדיל את הקוטר של הפתח, כך העובר יכול להיות pipetted מבלי לפגוע שק החלמון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי בקבוקי רולר נקי עם 1 מ&quot;ל של התקשורת לכל העובר. בהתאם לסוג בקבוקי רולר בשימוש מרבי של 3-6 עוברים יכול להיות טעון בבקבוק אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים באמצעות פיפטה לחתוך שלך בקבוק התקשורת מילאה את מכבש, נושאת על כמו Tyrodes שפחות כדי לא לדלל את התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את התקע גומי (פקק) לחלק העליון של בקבוק זכוכית רולר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בקבוקי רולר לתוך התוף תרבות רולר, כך חותם הדוק נוצר בין התקע ואת תוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הבקבוקים היו מחוברים, וכל משבצות ריקות התוף כבר חתום wפקקים גומי ith, להפעיל את מכבש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח CO 2 ו-O 2 טנקים ולהתאים אותם כ 2 psi, כך שסתום היציאה מפרסמת בועה לשנייה. עבור E8.5-E10 עוברים, 20% O 2 ו - 5% CO 2 אמור לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא החממה מוגדר 37 ° C ו לכסות או לסגור את החממה כך עוברים מוגנים מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים צריך להיבדק באופן תקופתי כדי להעריך את התפתחותם על ידי תוספת של somities, את ההתקדמות של מפנה, והיקף הסגר בצינור העצבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-3 שעות בתרבות, מעכבי תרופתי או טיפולים אחרים ניתן להוסיף אמצעי התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך המחקר צריכה לכלול בקרות, כגון כלי רכב או אנלוגים פעיל של מגיב המחקר. </li></ol> 6. לאחר הערכת התפתחות התרבות העובר כולו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיבוי גז, להפסיק רולר, ולהסיר בקבוקים מן החממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי העברה בחזרה Tyrodes או PBS בצלחת פטרי להערכת תחת stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שק החלמון אמור להופיע בלון דמוי, הלב צריך להיות גלוי קצב הלב צריך להיות&gt; 120 פעימות לדקה, ומחזור הדם צריך להיות ברור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום עוברי לפני הסרת שק החלמון במידת הצורך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שק חלמון מעובר על ידי חיתוך חור ליד EPC ו מעיפה את שק החלמון ואת amnion מעל הראש עכוז של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבל הטבור ניתן לחתוך כדי להפריד את שק החלמון של העובר ואת שק החלמון יכול לשמש genotyping את העובר במקרה הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את העובר במשך מספר somite ו למומים בצינור העצבי, כגון קפלי הגולגולת פתוחה, סגר חלקי של הפנים ו / או neuropore הזנב פתוח. עוברים יכול להיות מבוים על פי הסיווג Theiler שינויים המוךפו&quot;גנטי שהולך מרובים ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html</a> ) שוב, תיעוד מצולם שלהתפתחות העובר היא שימושית. </li></ol> 7. הערות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה באיכות גבוהה היא חיונית, כי כל ניק או דמעות של שק החלמון תמנע הפיכת מצליח לעכב התפתחות תקינה. EPC יכול גם להיות פגום במהלך הסרת הממברנה של רייכרט (RM), ואם EPC מופרד גם חלקית של שק החלמון, עוברים לא יפתחו כלל. עם זאת, ההסרה לא מושלמת של RM יכול לגרום עוברים להישאר ביחד ו / או תאים RM עשוי לגדול יותר בתרבות להצר הרחבת שק חלמון, אשר שניהם ימנע התפתחות תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים נקי וחד הם הסוד מקבל לנתיחה טוב, כי משעמם או מלקחיים כפוף להפוך את הליך משמעותי יותר קשה. פיקדונות חלבון על מכשירים יוביל נזק לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי, בקבוקי זכוכית סטרילית גם חיוני כדי למנוע עוברים יידבקו אל הקיר בצד היותו פגום. לפני תחילת הניסוי, בקבוקי צריך להיות scrubbed עם מים וסבון, ושטף DH 2 O, ו במיקרוגל עם כמות קטנה של מים בבקבוק אחד עד שהמים ירתחו. בקבוקים הם שטופים אז EtOH עם 70% ו מותר אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה מהר ככל האפשר, כי במוקדם העובר ניתן להעביר בתקשורת תרבות חיממו בחזרה 37 מעלות צלזיוס הישרדות טובים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם לנתח את החול כולו לפני העברת כל העוברים על בקבוקי רולר כך עובר כל בטמפרטורת החדר למשך אותו פרק זמן ולהימנע מיצירת פערים בצמיחה העובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשמור על סביבה סטרילית על מנת למנוע זיהום חיידקי של התרבויות. ניסויים בתרבות שלנו בוצעו ללא אנטיביוטיקה, אבל במעבדות רבות להוסיף אנטיביוטיקה התקשורת שלהם על מנת למנוע התפתחות חיידקים. המדיום אמור להופיע ברורה בסוף הניסוי כפי שהיה בתחילת הניסוי. אם התקשורת הפכה מעוננים או שיש לזרז גלוי, יש סיכוי קוןtamination כי נגוע בתרבות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוף הגזים יעיל יכול גם לעכב את התפתחות העובר, כדי להיות בטוח יש וסת אמין שיבטיחו אספקה ​​רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים לפתח כ -50% איטי יותר בתרבות vivo לשעבר, ולכן זה חיוני לספור somites כדי לוודא שאתה הגיעו לשלב ההתפתחות המתאים להשלמת הניסוי. </li></ol> 8. נציג תוצאות: הופעתו של עוברי טרום ופוסט מכבש התרבות מתוארת באיור 1. בזמן דיסקציה, עוברים צריכה להיות בתצורה הפוכה (איור 1 א, ד) שבו הזנב עומד מאחורי קפלי הראש. לאחר 36 שעות בתרבית, עוברי צריך להשלים מפנה, כך שהם נמצאים בעמדה, C-מעוקל העובר, שבו הזנב מול הראש (איור 1B, C, E, F). מניפולציה תרופתי עם RhoA קינאז מעכב (Y-27632), מעכב ידוע של הרחבה מתכנסת במהלךneurulation (Ybot-גונזלס, 2007), התוצאה היא קיצור של העוברים בציר שלהם מקורי, הזנב (איור 1E, F) ומעכב גולגולתי סגר לקפל עצביים. הנתונים שלנו מראים כי מינון גדל והולך של Y-27632 בהדרגה פוגעת סגר לקפל גולגולתי (איור 2A) ומקצרת את ציר הגוף (איור 2 ב), עולה בקנה אחד עם תפקידו של הזרם RhoA איתות neurulation גולגולת הרחבה מתכנסת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> באיור 1. מראה של עוברים תרבויות מניפולציה עם מעכב תרופתי Y-27632. (A, D) עוברים גזור על E8.5 לפני תרבות שלמה העובר (B, E) עוברים על E10 עם שק החלמון עדיין שלם, לאחר 36hrs של התרבות הרים. (C, F) שק חלמון הוסר כדי להמחיש מפנה מוצלחת הסגר בצינור העצבי. עוברים אשר טופלו עם Rho קינאז מעכב Y-27632 (E, F) הצליחה לעבור הרחבה מתכנסת נכונה להמחישציר הגוף מקוצר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> איור 2. השפעת מעכבי קינאז RhoA על סגירת הגולגולת בצינור העצבי ואת התארכות ציר. (א) אחוז עוברים כי היו מסוגלים בהצלחה קרוב קפלי הגולגולת שלהם (% NTC = סגירת הצינור העצבי אחוז) בהשוואה למינון של Y-27632 הוסיף התקשורת והתרבות. (ב) המרחק בין שלפוחית ​​forelimb otic ו צומצם משמעותית במינון הולך וגדל של Y-27632 (p &lt;0.05).

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היכולת להפריד בין האם, גורמים תוך רחמי מאלה מהותי לעובר במהלך התפתחותו הוא כלי חשוב ללימוד כל שלבי embryogenesis. כאן יש לנו ניתחו את ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה של קינאז RhoA על ברחם neurulation גולגולתי לשעבר, ובכך להסיר את חילוף החומרים משתנה האימהי של התרופה. זו מניפולציה תרופתי יש השפעה עמוקה על neurulation גולגולת הרחבה מתכנסת. רגישות תרכובת זו ניתן להשוות בין שונות גנטית עכברים מוטנטים. השיטה המוצגת כאן יכול להיות מיושם גם על מחקרים של מסלולים מולקולריים אחרים בפיתוח, המאפשר מניפולציה ישירה של פונקציית הסלולר עוברים באמצעות מגוון של חומרים כימיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Stereomicroscope עבור Dissection </td><td> לייקה </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Precision החממה </td><td> BTC הנדסה (בריטניה) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> סיבוב התרבות בקבוק היחידה </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית בקבוקים עבור סיבוב היחידה </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> גומי סיליקון באנג </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> קורק גומי סיליקון </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> גז Bubbler מפרצון </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> גז Bubbler מלכודת מפרצון </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> גז Bubbler Outlet </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> גז צילינדר </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> גז הרגולטור </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חולדה זכר סרום </td><td> הרלן מעבדות </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o פנול אדום </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק Filter </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> הביתור מספריים גדולים (טיפ בלאנט) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> אקסטרה פיין בון מספריים </td><td> כלי מדעי פיין (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><tד&gt; Dumot # 5 מלקחיים </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> של תמיסת מלח Tyrode </td><td></td><td></td><td> כפי שתואר Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 פנויה ס&quot;מ צלחת פטרי </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

מודלים העכבר גנטית הם כלי חשוב במחקר הסגר יונקים בצינור העצבי (Gray &amp; Ross, 2009; רוס, 2010). עם זאת, המחקר של עוברים ברחם העכבר הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת שלנו ישירות פרמקולוגית לתפעל את העוברים במנותק מן ההשפעות של מטבוליזם אימהית על מגיב של עניין. בין אם באמצעות מולקולה קטנה, חלבון רקומביננטי, או siRNA, אספקה ​​של חומרים אלה לאם, באמצעות תזונה או על ידי הזרקת יהיה כפוף התרכובות הללו יציבים למגוון ההגנות גוף שיכול למנוע מהם להגיע אל העובר. חקירות בתרבויות של עוברים כל יכול לשמש כדי להפריד אימהית מפני השפעות על התפתחות העובר מהותי. כאן, אנו מציגים שיטה עכבר עוברים culturing באמצעות מדיה מועשר במנגנון הרים החממה המאפשר סגירת נורמלי בצינור העצבי לאחר דיסקציה (קרוקט, 1990). לאחר בתרבות, עוברי יכוללטפל באמצעות קונבנציונאלי בטכניקות חוץ גופית כי שאחרת לא יהיה אפשרי אם העוברים היו עדיין ברחם. אחים עובריים ניתן לאסוף בנקודות זמן שונות כדי לחקור היבטים שונים של neurulation, המתרחשים מ-E7 7.5 (היווצרות צלחת עצביים, זמן קצר לפני תחילתו של neurulation) כדי E9.5-10 (בסיום neuropore לקפל הזנב גולגולתי הסגר, קאופמן, 1992). בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו לנתח עוברים על timepoints כי הם אופטימליים ללימוד neurulation גולגולתי. עוברים יהיה גזור על E8.5 (כ 10-12 somities), לאחר תחילת הסגר בצינור העצבי אבל לפני הפיכת העובר ואת הגולגולת סגירה לקפל עצביים, ומתוחזק בתרבות עד E10 (26-28 somities), כאשר הגולגולת neurulation צריכה להיות מלאה.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture at JoVE.com

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K Views.  Weill Cornell Medical College. שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.

Video: Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

חלבון לוקליזציה ב 3D תרבות גזע עצביים נייד: מתודולוגיה ויזואליזציה היברידי

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are located in the dorsal spinal cord and send their axons along stereotyped trajectories. Commissural axons initially project ventrally towards and then across the floorplate. After crossing the midline, these axons make a sharp rostral turn and project longitudinally towards the brain. Each of these steps is regulated by the coordinated activities of attractive and repulsive guidance cues. The correct interpretation of these cues is crucial to the guidance of axons along their demarcated pathway. Thus, the physiological contribution of a particular molecule to commissural axon guidance is ideally investigated in the context of the living embryo. Accordingly, gene knockdown in vivo must be precisely controlled in order to carefully distinguish axon guidance activities of genes that may play multiple roles during development.
Here, we describe a method to knockdown gene expression in the chicken neural tube in a cell type-specific, traceable manner. We use novel plasmid vectors3 harboring cell type-specific promoters/enhancers that drive the expression of a fluorescent protein marker, followed directly by a miR30-RNAi transcript4 (located within the 3'-UTR of the cDNA encoding the fluorescent protein) (Figure 1). When electroporated into the developing neural tube, these vectors elicit efficient downregulation of gene expression and express bright fluorescent marker proteins to enable direct tracing of the cells experiencing knockdown3. Mixing different RNAi vectors prior to electroporation allows the simultaneous knockdown of two or more genes in independent regions of the spinal cord. This permits complex cellular and molecular interactions to be examined during development, in a manner that is fast, simple, precise and inexpensive. In combination with DiI tracing of commissural axon trajectories in open-book preparations5, this method is a useful tool for in vivo studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance. In principle, any promoter/enhancer could be used, potentially making the technique more widely applicable for in vivo studies of gene function during development6.
This video first demonstrates how to handle and window eggs, the injection of DNA plasmids into the neural tube and the electroporation procedure. To investigate commissural axon guidance, the spinal cord is removed from the embryo as an open-book preparation, fixed, and injected with DiI to enable axon pathways to be traced. The spinal cord is mounted between coverslips and visualized using confocal microscopy.

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

A method by which gene expression in the neural tube can be downregulated in a cell type-specific, traceable manner is described. We demonstrate how in ovo electroporation of microRNA-based plasmids that elicit spatiotemporally controlled RNA interference can be used to investigate commissural axon guidance in the developing neural tube.

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...