ברצוננו להודות פיליפה וורן על עזרתה האדיבה.

1. גבול Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה יסוד: שקופיות לשכת הם מצופים Poly-D-ליזין שקופיות הזכוכית לילה ועקר מוכנים לפני תחילת הניסוי. בינוני מוכן באמצעות מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין-Fungizon (כוחות הביטחון הפלסטינים). גם בקבוק של תמיסת סידן / מגנזיום הנקס מלח חינם מאוזנת (HBSS) מוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשי שוואן עכברוש תאים בתרבית בבקבוק הם trypsinized 3 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. תרבות ראשיים astrocyte עכברוש הוא trypsinized במשך 5 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. טריפסין הוא inactived ידי הוספת DMEM בתוספת FCS 10% ו 1% כוחות הביטחון הפלסטינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinized בתאי שוואן ואת האסטרוציטים מועברים בנפרד 15 מ&quot;ל צינורות בז ו centrifuged ב 300 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאי שוואן ואת האסטרוציטים הם מחדש מושעה בצפיפות של 2 x 10 6 (ראה סעיף תוצאות נציג עבור וריאציות צפיפות התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 50 μL ההשעיה תא שוואן ממוקם בקצה אחד של PDL בארות שקופיות מצופה קאמרית. רצועת זכוכית שימש למרוח את הירידה לכיוון המרכז של החדר כדי ליצור קצה ישר. (בעזרת חותך זכוכית, coverslips זכוכית מלבני נחתכים longitudinally כך שהוא יתאים לרוחב החדר שקופיות המשמש מבחני גבול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה השנייה של μL 50 ההשעיה astrocyte הוצב בקצה השני של הבאר אותו מרוח לכיוון המרכז כדי ליצור קצה ישר במקביל למרוח את הירידה הראשון עם פער 0.2mm קטן ביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר שקופיות המכיל את טיפות ממוקמות בחממה ב -37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, תרבויות נשטפו עם DMEM להסיר שאינם מחוברים פסולת הסלולר בינוני טרי המכיל DMEM / 10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים הוסיף. הערה: DMEM / 10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים ניתן להוסיף forskolin (2μM) ותמצית יותרת המוח שור (BPE) (10μg / mL) לעורר התפשטות שוואן התא. BPE תספק גורמי גדילה הדרושים כדי לאפשר התרבות לטווח ארוך שוואן תאים forskolin מעלה את רמות מחזורית monophosphate אדנוזין בתוך התאים שוואן לגרום התפשטות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם תאים בתרבית במשך כ 8-10 ימים 37 ° C, 7% CO 2 באינקובטור. בינוני דורש להיות שונה כל 3 ימים. בשתי חזיתות התא יהיה בסופו של דבר להגיע לזה גבול חד יהוו בין שני סוגי התאים. בשלב זה הניסויים ניתן לבצע ניתוח הגורמים המעורבים ביצירת גבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף התרבות ניתן לתקן באמצעות פורמלדהיד 4% ותאי שוואן ניתן immunostained עם נוגדן אנטי P75 ו האסטרוציטים עם אנטי GFAP הנוגדנים לזהות את התאים בתרבית משותפת. P75 נוגדן מזהה זיקה נמוכה NGF הקולטן בתאי שוואן אשר האסטרוציטים העדר. Anti-GFAP נוגדן מזהה חלבון גליה firbrillary חומצי אשר localizes אל הציטופלסמה astrocyte. (ראה איור 1A עבור הגבול נציג) </li></ol> 2. הגירה Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 צלחות היטב (15mm בארות) הם PDL מצופה לילה ומוכן ליצירת monolayers astrocyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות astrocyte ראשונית היא trypsinized במשך 5 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. טריפסין הוא מובטל ידי הוספת DMEM בתוספת FCS 10% ו 1% כוחות הביטחון הפלסטינים לבין תא centrifuged ב 300 גרם במשך 5 דקות. (ראה תרשים 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסטרוציטים הם מחדש מושעה ב 1x10 5 תאים / מ&quot;ל. 1 מ&quot;ל של פתרון זה מתווסף מצופה כל PDL היטב 4 צלחות היטב. האסטרוציטים הם מתורבת של 24-48 שעות עד monolayer הוא ומחוברות לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך הגירה תא שוואן על monolayers astrocyte, במקביל ליצירת monolayers astrocyte, מעגלי PDL מצופה זכוכית coverslips ממוקמות בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל ומחץ בעזרת פיפטה פלסטיק ליצירת שברים קטנים של זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי זכוכית מועברים לתוך באר בצלחת 6 צלחת היטב באמצעות מלקחיים מתאים שברים בגודל נבחרים והושמו בארות אחרות. 5 שברי זכוכית ממוקמים היטב כל 6 צלחות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשי שוואן תאים בתרבית בקבוק הם trypsinized 3 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. Trypsinized בתאי שוואן מועברים נפרד צינור 15 מ&quot;ל בז ו centrifuged ב G 300 במשך 5 דקות. בתאי שוואן הם מחדש מושעה ב 2x 10 6 תאים / מ&quot;ל% DMEM/10 כוחות הביטחון הפלסטינים FCS / 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 טיפות μL ההשעיה בתאי שוואן נוסף על כל 5 שברי coverslip להציב 6 צלחות התאים היטב מודגרת ב 37 ° C CO, 7% 2 עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, התאים שוואן מחוברים שברי coverslip ו DMEM/10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים (בתוספת 2μM של forskolin 10μg ו / mL של BPE מתווסף גם כל כך שברי מכוסים לחלוטין עם בינוני) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 צלחות היטב המכיל שברי ממוקמות אז עבור 24-48 שעות בחממה עד שברי זכוכית הם con מלאשוטפת עם תאים שוואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שברי הם ומחוברות עם תאים שוואן, שבר כל הרים בזהירות בעזרת מלקחיים חד טבול HBSS להסיר תאים פנויים, ואז פנים הפוך על מנת monolayer astrocyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוב כל כך מכוסה עם 1 מ&quot;ל של% DMEM/10 FCS / 1% תאים כוחות הביטחון הפלסטינים לבין שוואן מותר להעביר לתקופה 24-48. במהלך תקופה זו ריאגנטים ניסיוניים כגון גורמי גדילה ניתן להוסיף על מנת להעריך את השפעתם על מספר ומרחק של הגירה של תאים שוואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הנדידה, שברי הזכוכית קבועים לתחתית גם כל על ידי הוספת paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות. בעקבות קיבעון, immunostain בתאי שוואן עבור p75 (הכרה נמוכה לקולטן זיקה NGF), לאחר מכן הכתם אותם באמצעות ערכת-ABC strepavidin diaminobenzidine (DAB), כדי לאפשר ויזואליזציה של תאים שוואן תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 3. נציג תוצאות: לאחר 8-10 ימים שוואן-astrocyte שיתוף תרבויות להראות גבול חד בין שני סוגי התאים. גבול זה בולט יותר אם forskolin ו BPE משמש בתרבות כמו התפשטות שוואן תאים מוגברת. אם אין גבול הוא ציין במהלך תקופה של 10 יום, זמן של התרבות ניתן להגדיל עוד יותר את הגבולות עד מבוססים. שינוי היחס בין צפיפות התאים היא דרך חלופית כדי להגביר את היווצרות הגבול. יחס של 3:01 שוואן: צפיפות התאים astrocyte ניתן להשתמש בעת הכנת תרחיפים תא 8,18. בעקבות immunostaining לזהות את התאים שוואן ואת האסטרוציטים, כדי להעריך את תא קו עירוב ניתן להסיק היכן הגבול הוא הקים את מספר התאים שוואן נודדים לשטח astrocyte ניתן לספור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להלן שתי דוגמאות של תמונות גבולות שהושגו, אחד עם הפרדה בנוי היטב בתאי שוואן ואת האסטרוציטים (איור 1A) ואחד שבו התאים לא מופרדים היטב לשטחים שונים בגלל טכניקה גרועה (איור 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="איור 1" /> . איור 1 assay גבול: שוואן-astrocyte אינטראקציה. א) ביום 10 שיתוף תרבות assay בנוכחות forskolin ו BPE לעורר התפשטות שוואן תא מדגים גבול חד בין שני סוגי תאים (אדום = P75, ירוק = GFAP). ב) יום 10 שיתוף תרבות assay היכן הגבול לא נוצרו שתי חזיתות תא מעורבת. זה היה בגלל ערבוב של שתי טיפות טיפות תוך שימת תא astrocyte ו שוואן סמוכים זה לזה במהלך תקופת ההכנה של הגבול (אדום = P75, ירוק = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הדימוי נציג monolayer astrocyte ומחוברות מבחני הגירה להעריך את התנועה של סוג תא אחד על פני השטח של סוג תא אחר ולכן להעריך תופעה שונה מזו של היווצרות הגבול. תרגול נחוץ כדי להבטיח היפוך coverslips על monolayers אינה מובילה לנזק שוואן תא מכוסה שברי זכוכית monolayers astrocyte ידי מלקחיים חדה. כדי להעריך את הנדידה של תאים שוואן, המרחק המקסימלי של הגירה ואת מספר התאים נודדים מקצה coverslip ניתן למדוד במיקרוסקופ אור. להלן תמונה של תאים שוואן מוכתם נוגדן P75 באמצעות מכתים DAB על פני השטח של monolayer astrocyte (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור הגירה באמצעות assay assay coverslip הפוכה. א) בתאי שוואן (חום, immunostained עם נוגדן p75) נודדות הרחק בקצה coverslip. החץ מצביע על כיוון של הגירה התא הרחק coverslip.

<ol>
	<li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors.">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li><li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells.">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li><li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+cell+adhesion+molecules:+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces.">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li><li>Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes,+Schwann+cells,+and+schwannomas+in+culture.">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li><li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve.">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li><li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord.">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li><li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival.">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter.">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li><li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture.">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li><li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures.">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li><li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface.">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li><li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord.">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li><li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells.">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li><li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes.">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li><li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell/astrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS/CNS+interfaces.">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li><li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced.">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li><li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF/heparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes:+a+role+in+astrocytosis.">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li><li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling.">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מבחני שתוארו לעיל שימשו במחקרים שונים הוכחת את התפקיד של גורמים רבים המעורבים היווצרות הגבול בין שוואן, האסטרוציטים ומוגבל הגירה שוואן תאים בסביבה astrocytic. הבנת המנגנונים האירועים הללו הוא חיוני כמו זה יאפשר פיתוח של אסטרטגיות כד...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41966-029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14170-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BPE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13028-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forskolin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>344273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverlips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR-International</td>
<td>631-0149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverlips(rectangle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics)</td>
<td>BB022050A1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc-LabTek </td>
<td>177380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4 well plates, 6 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 well plates 
6 well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>rat p75 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore, Temecula,California</td>
<td>MAB365</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFAP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dako</td>
<td>Z0334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary antibodies (Alexa-conjugated)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11004 A-11034</td>
<td>Goat anti mouse 568 
Goat anti Rabbit 488</td>
</tr>
<tr>
<td>Secondary biotinylated </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Goat anti mouse</td>
</tr>
<tr>
<td>DAB tablets </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>D4418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ABC elite kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6168</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorosave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>345789</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of schwann-astrocyte interactions using in vitro assays

בתאי שוואן אחד של תאים נפוץ אסטרטגיות לתקן בעקבות פגיעות בעמוד השדרה. בתאי שוואן מסוגלים לתמוך התחדשות axonal ומצמיח 1,2 על ידי הפרשת גורמי גדילה ומתן לקידום צמיחה מולקולות הדבקה 3 ומולקולות תאי מטריקס 4. בנוסף הם myelinate אקסונים demyelinated באתר של פגיעה 5. זאת בעקבות השתלת תאים שוואן לא להעביר מהאתר של השתל ולא להתערבב עם האסטרוציטים מארח 6,7. התוצאה היא היווצרות של גבול חד בין התאים שוואן ואת האסטרוציטים, יצירת מכשול עבור אקסונים הגוברת מנסה לצאת בחזרה השתל לרקמת מארח proximally ו distally. האסטרוציטים במגע עם תאים שוואן גם לעבור היפרטרופיה-up להסדיר את מולקולות המעכבות 8-13. ב מבחני חוץ גופית שימשו מודל שוואן תאים astrocyte אינטראקציות היה חשוב בהבנת המנגנון שבבסיס ההתנהגות הסלולר. אלה מבחני חוץ גופית כוללים assay הגבול, שם שותף תרבות נעשית באמצעות שני תאים שונים עם כל סוג תא הכובש בשטחים שונים עם פער קטן בלבד בין שני חזיתות התא. כאשר התאים להתחלק להגר, בשתי החזיתות הסלולר להתקרב זה לזה, ולבסוף מתנגשים. זה מאפשר את ההתנהגות של שתי האוכלוסיות הסלולר להיות מנותח בגבול. עוד וריאציה של הטכניקה היא אותו כדי לערבב את שתי האוכלוסיות הסלולר בתרבות לאורך זמן את שני סוגי תאים להפריד עם תאים שוואן בכבדות יחד איים בין האסטרוציטים יחד ליצירת מספר רב של שוואן-astrocyte גבולות. Assay second המשמשים בחקר האינטראקציה של שני סוגי התאים הוא assay הגירה שבו התנועה הסלולר יכול להיות מועבר על פני השטח של סוג תא אחר monolayer 14,15. Assay זה הידוע בכינויו assay coverslip הפוכה. בתאי שוואן הם מתורבתים על שברי זכוכית קטנים הם הפוכים עם הפנים כלפי מטה על פני השטח של monolayers astrocyte והגירה נבחנת מקצה coverslip. מבחני שניהם כבר סייעה בחקר המנגנונים המעורבים למעט הסלולר היווצרות הגבול. חלק זיהו מולקולות באמצעות טכניקות אלה כוללות N-Cadherins 15, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs) 16,17, FGF / הפרין 18, יבצע אפרים את גזר / Ephrins 19. בכוונת מאמר זה לתאר את הגבול ו assay assay הגירה באופן הדרגתי ולברר את הבעיות הטכניות אפשרי שעלול להתרחש.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays at JoVE.com

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

מאמר זה מתכוון לתאר באופן הדרגתי נפוץ<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני המשמש ללימוד שוואן תאים asrtocyte אינטראקציות.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

12.1K Views.  University of Cambridge. מאמר זה מתכוון לתאר באופן הדרגתי נפוץ במבחנה מבחני המשמש ללימוד שוואן תאים asrtocyte אינטראקציות.

Video: Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

ניתוח השוואתי של הורמון גדילה האנושית בסרום שימוש SPRi, ננו-SPRi ומבחני ELISA

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...