Мы хотели бы поблагодарить Филиппа Уоррен для нее вид помощи.

1. Граница Пробирной: <ol><li> Основные приготовления: Палата слайды покрыты поли-D-лизин в ночное время и стерильные стеклянные пластинки готовятся перед началом эксперимента. Средний которая подготовлена ​​с применением среднего Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), а 1% Пенициллин-Стрептомицин-Fungizon (НПФ). Также бутылку Кальций / Магний свободной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) получают. </li><li> Первичная крысы Шванн клетки культивировали в колбе трипсином в течение 3 минут с помощью 0,1% трипсина. Первичная культура астроциты крысы трипсином в течение 5 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсин является inactived, добавив DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PSF. </li><li> Трипсинизировали шванновских клеток и астроцитов передаются отдельные 15 мл сокола труб и центрифугировали при 300G в течение 5 минут. </li><li> Шванн клетки и астроциты повторно приостановил при плотности 2 х 10 6 (см. репрезентативные результаты раздел для изменения плотности клеток). </li><li> 50 мкл каплю суспензии клеток Шванн находится на одном конце PDL лунок слайд камеры. Стеклянную пластину был использован для мазка падение к центру камеры для получения прямой край. (Использование стеклорез, прямоугольные покровные стекла разрезаются продольно, так что она будет соответствовать ширине камеры слайдов используется для границы анализы) </li><li> Вторая капля 50 мкл астроцитов подвески была помещена на противоположном конце того же хорошо и смазывают по направлению к центру, чтобы создать линейку параллельно первой мазка падение с небольшой толщиной 0,2 мм зазор между ними. </li><li> Камера слайды содержащие капли помещают в инкубатор при 37 ° С в течение 2 часов. </li><li> Через 2 часа, культуры промывают DMEM удалять не подключенных распада клеток и свежей среде, содержащей DMEM / 10% FCS / 1% PSF добавил. Примечание: DMEM / 10% FCS / 1% PSF может быть дополнена форсколина (2 мкм) и говядине гипофизарный экстракт (BPE) (10 мкг / мл) стимулирует пролиферацию клеток Шванн. BPE будет поставлять факторов роста необходимо, чтобы позволить долгосрочное ячейки Шванн культуры и форсколина поднимает циклический аденозин монофосфат уровней в шванновских клеток индуцировать пролиферацию </li><li> Клетки культивировали в течение примерно 8-10 дней при температуре 37 ° C, 7% СО 2 инкубатора. Среда требует, чтобы менять каждые 3 дня. Два фронта клетка в конце концов достигнет друг с другом и резкую границу образуют между этими двумя типами клеток. На этом этапе эксперименты можно проводить анализ факторов, влияющих на формирование границы. </li><li> Сотрудничество культуры могут быть исправлены с помощью 4% формальдегида и Шванн клетки могут быть immunostained с анти-P75 антител и астроциты с анти-GFAP антител для идентификации клеток в совместной культуре. P75 антитело распознает низких сродство рецепторов NGF на клетки астроциты Шванн которых не хватает. Анти-GFAP антитело распознает глиальных firbrillary кислой белок, который локализуется в цитоплазме астроцитов. (Пожалуйста, см. Рисунок 1A для представителя границе) </li></ol> 2. Миграция Пробирной: <ol><li> 4 луночных планшетах (15 мм скважины) PDL покрытием в ночное время и готовы к созданию астроцитов монослоев. </li><li> Первичная астроцитов культура трипсином в течение 5 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсин является инактивированной, добавив DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PSF и клеточной центрифугировали при 300G в течение 5 минут. (См. рисунок 2) </li><li> Астроциты повторно прерывается в 1х10 5 клеток / мл. 1 мл этого раствора добавляют в каждую лунку, покрытую PDL в 4 и пластин. Астроциты культивируют в течение 24-48 часов, пока монослой полностью вырожденная. </li><li> Для оценки Шванн миграции клеток монослоя на астроциты, параллельно создав астроцитов монослоев, круговая PDL покрытием покровные стекла помещают в 50 мл трубки и раздавил использованием пластиковой пипетки для создания небольших фрагментов стекла. </li><li> Стекло фрагменты переданы в хорошо в 6 хорошо блюдо пластину и с помощью щипцов подходящий размер фрагментов выбраны и размещены в других скважинах. 5 осколки стекла помещают в каждую лунку в 6 и пластин. </li><li> Первичные элементы Шванн культивировали в колбе трипсином в течение 3 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсинизировали шванновских клеток передаются отдельные 15 мл сокола трубки и центрифугировали при 300 G в течение 5 минут. Шванн клетки ресуспендировали на 2x 10 6 клеток / мл в DMEM/10% FCS / 1% PSF. </li><li> 20 мкл капли суспензии Шванн клеток добавляли в течение каждых 5 покровное фрагменты помещены в 6 хорошо пластин и клетки инкубируют при температуре 37 ° C, 7% CO 2 в течение 2 часов. </li><li> Через 2 часа, Шванн клетки прикрепляются к покровным фрагменты и DMEM/10% FCS / 1% PSF (с добавлением 2 мкм форсколина и 10 мкг / мл BPE добавляется в каждую лунку, так что фрагменты полностью покрыты среды) . </li><li> 6 хорошо чашки, содержащие фрагменты затем помещаются в инкубатор на 24-48 часа, пока осколки стекла, полностью консвободно с клетками Шванн. </li><li> Как только фрагменты сливающийся с клетками Шванн, каждый фрагмент подобран тщательно острыми щипцами и опускают в HBSS, чтобы удалить одинокие клетки, а затем перевернутой лицом вниз на астроциты монослоя. </li><li> Каждая скважина затем покрывается 1 мл DMEM/10% FCS / 1% PSF и Шванн клетки могут мигрировать от 24 до 48 периода. В течение этого периода экспериментального реагентов, таких как факторы роста могут быть добавлены, чтобы оценить их влияние на количество и расстояния миграции клеток Шванн. </li><li> После миграции период, осколки стекла крепятся к нижней части каждой лунки, добавляя 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 минут. После фиксации, immunostain Шванн клеток для p75 (учитывая низкую аффинность рецепторов NGF), то окраска их с помощью АВС-Комплект strepavidin диаминобензидина (DAB), чтобы обеспечить визуализацию шванновских клеток под световым микроскопом. </li></ol> 3. Представитель Результаты: После 8-10 дней Шванн-астроцитов совместно культур показывают резкую границу между этими двумя типами клеток. Эта граница является более выраженным, если форсколина и BPE используется в культуре как Шванн пролиферации клеток усиливается. Если нет границы наблюдается в течение 10 дней, время культура может быть увеличен еще до границы устанавливаются. Изменение соотношения плотности клеток является альтернативным способом увеличения границы формации. Соотношении 3:1 Шванн: астроцитов плотность клеток могут быть использованы при подготовке клеточные суспензии 8,18. После иммуноокрашивания определить Шванн клетки и астроциты, оценить ячейки смешение линии могут быть сделаны где граница устанавливается и количество клеток Шванн мигрирующие в астроциты территории можно пересчитать под флуоресцентным микроскопом. Ниже приведены два примера изображений, полученных границы, одно хорошо сформировавшейся сегрегации шванновских клеток и астроцитов (рис. 1А) и тот, где клетки не отделены хорошо в различных территориях из-за плохой техники (рис. 1В). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Рисунок 1" /> . Рисунок 1 Граница анализа: Шванн-астроцитов взаимодействия. А) 10 день со-культура тест, в присутствии форсколина и BPE, чтобы стимулировать пролиферацию клеток Шванн демонстрирует резкую границу между этими двумя типами клеток (красный = P75, зеленый = GFAP). Б) 10 день со-культуры анализа, где границы не образуется и двух фронтах ячейки смешанные. Это было связано с перемешиванием две капли при размещении астроцитов и Шванн капель ячейки рядом друг с другом во время подготовки границы (красный = P75, зеленый = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Представителю образ сливной астроцитов монослоя Миграция тесты оценки движения одного типа клеток по поверхности другого типа клеток и, следовательно, оценивать различные явления от граничных образования. Практика необходима для обеспечения обращения покровные на монослоев не приводит к повреждению Шванн ячейки покрытые осколками стекла и астроцитов монослоев резким щипцами. Для оценки миграции клеток Шванн, максимальное расстояние миграции и числа мигрирующих клеток от края покровного может быть измерена в световой микроскоп. Ниже представлена ​​картинка шванновских клеток окрашивали антителами P75 использования DAB пятен на поверхности астроцитов монослоя (рис. 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Миграция методом с использованием перевернутой анализа покровное. ) Шванн клеток (коричневый, immunostained с p75 антитела) мигрируют от края покровного. Стрелка указывает на направление миграции клеток от покровного стекла.

<ol>
	<li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors.">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li><li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells.">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li><li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+cell+adhesion+molecules:+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces.">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li><li>Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes,+Schwann+cells,+and+schwannomas+in+culture.">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li><li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve.">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li><li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord.">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li><li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival.">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter.">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li><li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture.">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li><li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures.">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li><li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface.">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li><li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord.">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li><li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells.">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li><li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes.">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li><li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell/astrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS/CNS+interfaces.">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li><li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced.">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li><li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF/heparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes:+a+role+in+astrocytosis.">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li><li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling.">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Анализы, описанные выше, были использованы в различных исследований, демонстрирующих роль несколько факторов, влияющих на формирование границы между Шванн-астроциты и ограниченной ячейке Шванн миграции в астроцитарных окружающей среды. Понимание механизмов лежащих в...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41966-029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14170-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BPE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13028-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forskolin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>344273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverlips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR-International</td>
<td>631-0149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverlips(rectangle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics)</td>
<td>BB022050A1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc-LabTek </td>
<td>177380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4 well plates, 6 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 well plates 
6 well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>rat p75 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore, Temecula,California</td>
<td>MAB365</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFAP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dako</td>
<td>Z0334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary antibodies (Alexa-conjugated)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11004 A-11034</td>
<td>Goat anti mouse 568 
Goat anti Rabbit 488</td>
</tr>
<tr>
<td>Secondary biotinylated </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Goat anti mouse</td>
</tr>
<tr>
<td>DAB tablets </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>D4418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ABC elite kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6168</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorosave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>345789</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of schwann-astrocyte interactions using in vitro assays

Шванн клетки являются одним из наиболее часто используемых клетками в ремонт стратегии следующие повреждения спинного мозга. Шванн клетки способны поддерживать аксонального регенерации и прорастанию на 1,2 секретирующие фактор роста и оказания содействия росту молекул адгезии 3 и внеклеточной матрицы молекул 4. Кроме того, они myelinate демиелинизированные аксонов в месте повреждения 5. Однако после трансплантации, Шванн клетки не мигрируют с места имплантата и не смешиваются с принимающей астроциты 6,7. Это приводит к образованию резкой границы между клетками Шванн и астроцитов, создавая препятствие для роста аксонов пытается выйти трансплантата обратно в ткани хозяина проксимально и дистально. Астроциты в контакт с клетками Шванн также подвергаются гипертрофии и постоянно регулировать тормозное молекул 8-13. В пробирке тесты были использованы для моделирования Шванн клеточных взаимодействий и астроциты играют важную роль в понимании механизмов, лежащих в основе сотовой поведения. Эти тесты в пробирке включают границы анализа, где со-культуры осуществляется с помощью двух различных клеток каждого типа клеток занимающих разные территории только с небольшой разрыв, отделяющий два фронта клетки. Как клетки делятся и мигрируют, два сотовых фронтах стать ближе друг к другу и, наконец, сталкиваются. Это позволяет поведение двух клеточных популяций, которые будут проанализированы на границе. Другой вариант того же метода является сочетание двух клеточных популяций в культуре и в течение долгого времени два типа клеток выделять с клетками Шванн слипаются вместе, как между островами в астроциты вместе создание нескольких Шванн-астроцитов границ. Второй анализа используются при изучении взаимодействия двух типов клеток является миграция анализа, где сотовая движение можно проследить на поверхности другого типа клеток монослоя 14,15. Этот анализ обычно известен как перевернутая анализа покровное. Шванн клетки культивируют на мельчайшие осколки стекла, и они обращены лицевой стороной вниз на поверхности астроцитов монослоев и миграции оценивается от края покровного. И анализы играют важную роль в изучении основных механизмов, участвующих в клеточном изоляции и границы образования. Некоторые из молекул определяется с помощью этих методов включают N-Кадгерины 15, хондроитин сульфат протеогликаны (CSPGs) 16,17, FGF / Гепарин 18, Еф / Ephrins 19. В этой статье намерен описать анализа границ и миграции в анализе поэтапно и выяснить возможные технические проблемы, которые могут возникнуть.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays at JoVE.com

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

В этой статье намерен описать поэтапно часто используемых<em&gt; В пробирке</em&gt; Тесты, используемые при изучении Шванн клеточной asrtocyte взаимодействий.

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

12.1K Views.  University of Cambridge. В этой статье намерен описать поэтапно часто используемых В пробирке Тесты, используемые при изучении Шванн клеточной asrtocyte взаимодействий.

Video: Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Быстрое однородных Обнаружение биологических экспериментов с использованием магнитных система биодатчиков модуляции

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 &#39;Конец расщепление пре-мРНК подложках<em&gt; В пробирке</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

В пробирке агрегации анализов с помощью гиперфосфорилированного тау-белок

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

Сравнительный анализ человеческого гормона роста в сыворотке, используя SPRI, Nano-SPRI и ELISA Анализы

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Влияние на Fusion партнеров с помощью анализов токсичности Хантингтона в дрожжи флуоресцентных белков

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

В пробирке Анализ функции E3 убиквитин лигазы

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...