نود أن نشكر فيليبا ارن للحصول على مساعدة عينية لها.

1. حدود الفحص : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد الشرائح المغلفة الدائرة مع بولي - D - يسين الشرائح الزجاجية بين عشية وضحاها ومعقمة قبل بدء التجربة : إعداد الأساسية. مستعدة المتوسطة التي تستخدم في التعديل متوسطة Dulbecco النسر (DMEM) ، على أن تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) ، و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين - Fungizon (PSF). كما يتم تحضير زجاجة من الكالسيوم / المغنيسيوم حل هانكس مجانا الملح المتوازن (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtrypsinized الأولية الفئران خلايا شوان المستزرعة في قارورة لمدة 3 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو trypsinized الأولية ثقافة نجمية الفئران لمدة 5 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو inactived التربسين بإضافة DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ PSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل Trypsinized خلايا شوان والخلايا النجمية لفصل 15 مل أنابيب الصقر وطرد في 300G لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي خلايا شوان والخلايا النجمية إعادة علقت في كثافة 2 × 10 6 (انظر القسم لممثل نتائج التغيرات في كثافة الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع قطرة 50 ميكرولتر من تعليق خلية شوان في نهاية واحدة من الآبار المغلفة PDL الشريحة الغرفة. وقد استخدم الشريط الزجاج لتشويه الانخفاض نحو وسط الغرفة لإنشاء حافة مستقيمة. (استخدام قطع الزجاج ، وقطع الزجاج coverslips مستطيلة طوليا بحيث أنه يلائم عرض الشرائح المستخدمة في غرفة المقايسات الحدود) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت قطرة والثاني من 50 ميكرولتر من تعليق نجمية في الطرف الآخر من نفس البئر وطخت نحو الوسط لخلق حافة مستقيمة موازية للتشهير مع أول قطرة صغيرة 0.2mm فجوة بينهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغرفة التي تحتوي على شرائح توضع قطرات في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة ، وكانت تغسل مع الثقافات DMEM لإزالة غير المرفقة الحطام الخلوية والمتوسطة الطازجة التي تحتوي على DMEM / 10 ٪ FCS / 1 ٪ PSF المضافة. ملاحظة : DMEM / 10 ٪ FCS / 1 ٪ يمكن أن تستكمل قوات الأمن الفلسطينية مع forskolin (2μM) واستخراج الغدة النخامية البقري (BPE) (10μg / مل) تحفز تكاثر الخلايا شوان. وسوف تزود BPE عوامل النمو اللازمة للسماح طويلة المدى خلية شوان الثقافة وforskolin يثير مستويات الأدينوزين الحلقي الأدينوساين داخل خلايا شوان للحث على الانتشار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استزراع خلايا لحوالي 8-10 أيام عند 37 درجة مئوية ، و 7 ٪ CO 2 الحاضنة. المتوسط ​​يتطلب تغيير كل 3 أيام. سوف الجبهات الخلية two تصل في النهاية بعضها البعض ، وحدود حادة ستشكل بين أنواع الخلايا اثنين. ويمكن في هذه المرحلة يتم تحليل التجارب من العوامل التي تدخل في تشكيل الحدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ان تكون ثابتة شارك في ثقافة استخدام الفورمالدهايد 4 ٪ ويمكن immunostained خلايا شوان مع P75 المضادة للأجسام المضادة والخلايا النجمية مع أجسام مضادة للGFAP لتحديد الخلايا في الثقافة المشتركة. P75 الضد تعترف منخفضة تقارب NGF مستقبلات على خلايا شوان التي تفتقر الخلايا النجمية. الأضداد المضادة للGFAP تعترف الدبقية firbrillary البروتين الحمضية التي يموضع إلى السيتوبلازم نجمية. (يرجى الرجوع إلى الشكل 1A ممثل عن الحدود) </li></ol> 2. الهجرة الفحص : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 لوحات جيدا (15mm الآبار) والمغلفة PDL بين عشية وضحاها ، وأعد لخلق monolayers نجمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة هي trypsinized نجمية الابتدائية لمدة 5 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو المعطل التربسين بإضافة DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ PSF وطرد في الخلية 300G لمدة 5 دقائق. (انظر الشكل 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والنجمية إعادة علقت في الخلايا 1x10 5 / مليلتر. يضاف 1 مل من هذا الحل لكل PDL مغلفة جيدا في 4 لوحات جيدا. يتم استزراع الخلايا النجمية ل24-48 ساعة حتى أحادي الطبقة غير متلاقية تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم شوان الهجرة خلية على monolayers نجمية ، بالتوازي مع خلق monolayers نجمية ، يتم وضع الزجاج الدائرية coverslips PDL المغلفة في أنبوب 50 مل وسحقت باستخدام ماصة بلاستيكية لإنشاء أجزاء صغيرة من الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل شظايا الزجاج في بئر في 6 طبق طبق بشكل جيد ومناسب باستخدام الملقط شظايا يتم اختيار الحجم وتوضع في آبار أخرى. توضع شظايا الزجاج 5 في كل بئر في 6 لوحات جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtrypsinized الأولية خلايا شوان المستزرعة في قارورة لمدة 3 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. يتم نقل Trypsinized خلايا شوان لفصل 15 مل أنبوب الصقر وطرد في 300 G لمدة 5 دقائق. هي خلايا شوان إعادة علقت في 2X 10 6 خلية / مل في DMEM/10 ٪ PSF FCS / 1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف 20 قطرات ميكرولتر من خلايا شوان تعليق على كل أجزاء ساترة 5 6 لوحات وضعت في الخلايا بشكل جيد ويتم تحضين في 37 ° C CO ، 7 2 ٪ لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة ، هي التي تعلق على خلايا شوان إلى شظايا ساترة وDMEM/10 ٪ FCS / 1 ٪ PSF (تستكمل مع 2μM من forskolin و10μg / مل من BPE يضاف إلى كل بئر بحيث يتم تغطيتها بالكامل مع شظايا متوسطة) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم توضع على لوحات تحتوي على 6 جيدا شظايا في حاضنة لل24-48 ساعة حتى شظايا الزجاج ويخدع بالكاملبطلاقة مع خلايا شوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة هي شظايا متموجة مع خلايا شوان ، واختار كل قطعة بعناية حتى باستخدام الملقط حادة وتراجع في HBSS لإزالة الخلايا غير مرتبط ثم وجه مقلوب أسفل إلى المونولاير نجمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تغطية كل جيدا مع 1 مل من DMEM/10 ٪ مسموح FCS / 1 ٪ PSF وخلايا شوان لترحيل للفترة 24-48. ويمكن خلال هذه الفترة التجريبية يمكن إضافة الكواشف مثل عوامل النمو لتقييم تأثيرها على عدد وبعد الهجرة من خلايا شوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة والهجرة ، ويتم إصلاح شظايا الزجاج في الجزء السفلي من كل بئر وذلك بإضافة بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة. التثبيت التالية ، immunostain خلايا شوان لP75 (الاعتراف انخفاض مستقبلات تقارب NGF) ثم وصمة عار لهم باستخدام ABC strepavidin محفظة diaminobenzidine (DAB) ، للسماح التصور للخلايا شوان تحت المجهر الخفيفة. </li></ol> 3. ممثل النتائج : بعد 8-10 أيام شفان نجمية المشترك الثقافات تظهر حدود حادة بين أنواع الخلايا اثنين. هذه الحدود هي أكثر وضوحا إذا تم استخدام forskolin وBPE في الثقافة وشوان تكاثر الخلايا ويتعزز. إذا لوحظ أي الحدود خلال الفترة من يوم 10 ، ويمكن زيادة الوقت للثقافة أخرى حتى يتم تأسيس حدود. تغيير نسبة كثافة الخلية هو وسيلة بديلة لزيادة تكوين الحدود. ويمكن استخدام الخلايا نجمية الكثافة عند إعداد تعليق الخلية 8،18 : نسبة شفان 3:1. immunostaining التالية للتعرف على خلايا شوان والخلايا النجمية ، لتقييم اختلاط الخلية يمكن رسم خط حيث تم تأسيس الحدود ويمكن عدها عدد خلايا شوان يهاجرون إلى الأراضي نجمية تحت المجهر مضان. وأدناه مثالين من الصور التي تم الحصول عليها حدود ، واحدة مع الفصل بشكل جيد من خلايا شوان والخلايا النجمية الشكل (1A) واحد حيث لم يفصل الخلايا بشكل جيد في المناطق المختلفة بسبب أسلوب الفقراء (الشكل 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="الشكل 1" /> مقايسة الحدود الرقم 1 : شفان نجمية التفاعل. أ) لمدة 10 أيام شارك في ثقافة الفحص في حضور وforskolin BPE شوان لتحفيز تكاثر الخلايا يوضح حدود حادة بين أنواع الخلايا اثنين (الحمراء = P75 ، أخضر = GFAP). ب) يوم 10 شارك في الثقافة مقايسة حيث لم يتم تشكيل الحدود والجبهات two الخلية المختلطة. كان هذا بسبب اختلاط قطرات اثنين في حين وضع قطرات خلية نجمية وشوان بجوار بعضها البعض أثناء إعداد الحدود (الحمراء = P75 ، أخضر = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. صورة ممثل المونولاير نجمية متكدسة المقايسات تقييم حركة الهجرة من نوع خلية واحدة على سطح الخلية ونوع آخر تقييم بالتالي ظاهرة مختلفة عن تلك التي تشكل الحدود. وهناك حاجة لضمان الممارسة على عكس coverslips على monolayers لا يؤدي إلى الأضرار التي لحقت خلية شوان المغطاة شظايا الزجاج وmonolayers نجمية بواسطة الملقط حادة. ويمكن لتقييم الهجرة من خلايا شوان ، والمسافة القصوى للهجرة وعدد من الخلايا المهاجرة من على حافة ساترة تقاس تحت المجهر الخفيفة. وأدناه صورة خلايا شوان ملطخة P75 باستخدام الأجسام المضادة تلطيخ DAB على سطح المونولاير نجمية (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> فحص الهجرة الرقم 3. مقلوب باستخدام مقايسة ساترة. أ) خلايا شوان (البني ، immunostained مع P75 الضد) المهاجرة بعيدا عن حافة ساترة. يشير السهم إلى اتجاه الهجرة بعيدا عن الخلية ساترة.

<ol>
	<li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors.">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li><li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells.">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li><li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+cell+adhesion+molecules:+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces.">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li><li>Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes,+Schwann+cells,+and+schwannomas+in+culture.">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li><li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve.">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li><li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord.">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li><li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival.">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter.">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li><li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture.">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li><li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures.">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li><li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface.">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li><li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord.">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li><li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells.">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li><li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes.">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li><li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell/astrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS/CNS+interfaces.">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li><li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced.">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li><li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF/heparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes:+a+role+in+astrocytosis.">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li><li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling.">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

استخدمت المقايسات المبينة أعلاه في الدراسات المختلفة مما يدل على دور عوامل متعددة تشارك في تشكيل الحدود بين شفان النجمية ومحدودية الهجرة خلية شوان في بيئة نجمي. فهم الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث هو ضروري لأنه يسمح بوضع استرا?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41966-029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14170-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BPE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13028-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forskolin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>344273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverlips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR-International</td>
<td>631-0149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverlips(rectangle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics)</td>
<td>BB022050A1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc-LabTek </td>
<td>177380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4 well plates, 6 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 well plates 
6 well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>rat p75 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore, Temecula,California</td>
<td>MAB365</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GFAP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dako</td>
<td>Z0334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary antibodies (Alexa-conjugated)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11004 A-11034</td>
<td>Goat anti mouse 568 
Goat anti Rabbit 488</td>
</tr>
<tr>
<td>Secondary biotinylated </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Goat anti mouse</td>
</tr>
<tr>
<td>DAB tablets </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>D4418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ABC elite kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6168</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorosave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>345789</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of schwann-astrocyte interactions using in vitro assays

خلايا شوان هي واحدة من الخلايا تستخدم عادة في استراتيجيات إصلاح التالية اصابات النخاع الشوكي. خلايا شوان هي قادرة على دعم التجديد ومحواري تنتشر عن طريق إفراز عوامل النمو وتوفير النمو 1،2 تعزيز التصاق الجزيئات والجزيئات 3 4 المصفوفة خارج الخلية. بالإضافة إلى أنها myelinate المحاوير عديمة الميلين في موقع الإصابة 5. لكن بعد الزرع ، وخلايا شوان لا تهاجر من موقع والزرع لا تتداخل مع المضيف 6،7 النجمية. هذه النتائج في تشكيل حدود حادة بين خلايا شوان والخلايا النجمية ، وخلق عقبة أمام تزايد المحاوير تحاول الخروج من الكسب غير المشروع مرة أخرى في النسيج المضيف قريب وبشكل أقصى. النجمية على اتصال مع خلايا شوان يخضع أيضا تضخم وتصل تنظيم الجزيئات المثبطة 8-13. في فحوصات المختبر استخدمت لنموذج التفاعلات خلية نجمية شوان وكانت مهمة في فهم الآلية الكامنة وراء السلوك الخلوية. هذه المقايسات في المختبر وتشمل فحص الحدود ، حيث يتم إجراء التعاون ثقافة باستخدام اثنين من خلايا مختلفة مع كل نوع من الخلايا الأراضي المحتلة مختلفة مع فجوة صغيرة فقط تفصل بين الجبهات الخلية اثنين. كما انقسام الخلايا ، وترحيل ، والجبهتين الخلوية الاقتراب من بعضها البعض ، وتصطدم في نهاية المطاف. هذا يسمح للسلوك المجموعتين السكانيتين الخلوية ليتم تحليلها على الحدود. اختلاف آخر من نفس الأسلوب هو مزيج المجموعتين السكانيتين الخلوية في الثقافة وبمرور الوقت أنواع الخلايا two عزل خلايا شوان مع تجمعت معا كما في الجزر بين النجمية خلق معا متعددة شفان نجمية الحدود. في مقايسة الثانية المستعملة في دراسة التفاعل بين أنواع الخلايا اثنين هو مقايسة الهجرة حيث يمكن تتبع حركة الخلوية على السطح من نوع من الخلايا الأخرى المونولاير 14،15. ومن المعروف عموما هذا الاختبار كما مقايسة ساترة مقلوب. يتم استزراع خلايا شوان على شظايا زجاجية صغيرة والمقلوب التي يواجهونها باستمرار على سطح monolayers نجمية ويتم تقييم الهجرة من على حافة ساترة. وقد تم كل من المقايسات مفيدة في دراسة الآليات الكامنة وراء المشاركة في استبعاد الخلوية وتشكيل الحدود. حددت بعض الجزيئات باستخدام هذه التقنيات تشمل Cadherins N - 15 ، شوندرويتين البروتيوغليكان كبريتات (CSPGs) 16،17 ، جمعية جيل المستقبل / الهيبارين 18 ، أفسس / Ephrins 19. وتعتزم هذه المقالة لوصف مقايسة الحدود والهجرة في مقايسة أزياء متدرج وإلقاء الضوء على المشاكل التقنية الممكنة التي قد تحدث.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays at JoVE.com

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

وتعتزم هذه المقالة لوصف بطريقة متدرجة واستخداما<em&gt; في المختبر</em&gt; المقايسات المستخدمة في دراسة الخلية شوان asrtocyte التفاعلات.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

12.2K Views.  University of Cambridge. وتعتزم هذه المقالة لوصف بطريقة متدرجة واستخداما في المختبر المقايسات المستخدمة في دراسة الخلية شوان asrtocyte التفاعلات.

Video: Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 &#39;نهاية الشق من قبل مرنا ركائز<em&gt; في المختبر</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

تحليل مقارن لهرمون النمو البشري في المصل عن طريق سبري، نانو-سبري وELISA فحوصات

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video