נתמך בחלקו על ידי מענק ונדרבילט CTSA 1 UL1 RR024975 של המרכז הלאומי למשאבי מחקר, המכונים הלאומיים לבריאות. עבודה זו מומנה על ידי NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

בשביל הפרוטוקול הבא, אנו משתמשים בתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) כמו התאים של עניין. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להשתמש עם סוגי תאים אחרים. בצע את assay במנדף רקמות התרבות באמצעות טכניקה סטרילית. יום 1: הכנת צלחת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את הצלחת ELISPOT ופתח אותו למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 150 μL של 1X PBS באמצעות pipettor רב, אם ניתן, גם pipetting יחיד אחרת מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את חבילת מאגרים לפתוח אותו למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של הנוגדן ללכוד, אנטי אנושי אינטרפרון-γ, עד 11 MLS של 1X PBS. וורטקס היטב. העברת תערובת נוגדנים למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μL של הפתרון ציפוי זה לתוך זה גם שימוש רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את הצלחת parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת במקרר למשך הלילה. הצלחות טובים במשך שבועות. כלל האצבע הוא שאם יש עדיין נשאר נוזלי את הבארות, את הצלחת יכול לשמש. </li></ol> תא הכנה אם PBMCs הם טריים ואז לספור את התאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. עבור PBMC מאוחסנים חנקן נוזלי, מפשיר של תאים הכרחי. הפרוטוקול הוא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה cryovial של תאים 37 ° C אמבט מים עד מופשר כמעט לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מיד ב 5 מ&quot;ל של R10 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 5 דקות ב 225 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שוב ב 5 מ&quot;ל של R10 מדיה לספור את התאים קיימא באמצעות trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו הריכוז 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ב R10 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנוחה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> יום 2: קביעת-Up פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עם מכסה לייבל מספר זיהוי הדגימה, תנאים טוב, ותאריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 150 μL של סטרילית 1x PBS באמצעות ה-dump שיטת כתם. היזהר לא להתיז את הצלחת בעת ההטלה. הדבר עלול לגרום בארות הצלחת להפוך סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של R20 היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צלחת הוא דוגרים, לספור את התאים היו נח בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה תא בסל&quot;ד 1500 למשך 5 דקות. למזוג supernatant ו resuspend גלולה, כך יש לך ריכוז סופי של 1x10 6 תאים לכל 1mL ב R10 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את R20 באמצעות ה-dump שיטת כתם. היזהר לא להתיז את הצלחת בעת ההטלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של פתרון תאים (10 5 תאים) כדי היטב כל אחד. הוסף פפטידים מתאימים ו / או אנטיגנים על בארות המקביל כפולים. השתמש קצה פיפטה חדשה בכל פעם שאתה נכנס הפתרון עובד פפטיד. ריכוז הפפטיד רגיל הוא 10-40 מיקרוגרם / מ&quot;ל. מאז פפטידים להשתנות, כל חוקר צריך לכיל פפטידים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב בארות בקרה שלילית, רק להוסיף תאים (לא פפטידים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב בארות בקרה חיובית, להוסיף phytohemagglutinin (PHA; 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל; סיגמא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2 (~ 18 שעות). </li></ol> יום 3: פיתוח פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 150 1xPBS μL באמצעות ה-dump שיטת כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 PBS μL היטב כל הצלחת באמצעות pipettor רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת במקרר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את הצלחת מהמקרר ומניחים אותו על מכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון נוגדן ביוטין <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של נוגדן ביוטין (מב 7-B6-1) כדי 11mL PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מתכננים להוסיף את הפתרון באמצעות רב, לשפוך אותה לתוך המאגר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS על ידי מצליף אותה לפח. היזהר לא להתיז את הצלחת בעת ההטלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μL של פתרון זה לתוך זה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת מכסה את הרקמה תרבות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6 פעמים צלחת עם 150μL 1xPBS באמצעות ה-dump שיטת כתם. ביום לשטוף את ה 6, תשאיר את PBS על הצלחת עד שהכנת את הנוגדן streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן streptavidin. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5.5 μ l streptavidin נוגדן (streptavidin-ALP) כדי 11mL PBS (1:2000 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מתכננים להוסיף את הפתרון באמצעות רב, לשפוך אותה לתוך המאגר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS שנותרו בארות למחוק את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של פתרון streptavidin היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת מכסה את הרקמה תרבות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות 6 פעמים עם PBS באמצעות ה-dump שיטת כתם. ביום לשטוף את ה 6, תשאיר את PBS על הצלחת עד שביצעת את הפתרון צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בחושך. הכן את phosphatase אלקליין המצע פתרון (אלקליין תשתית phosphatase ערכת IV BCIP / NBT): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של ריאגנט המצע 1-11 מ&quot;ל טריס חיץ, מערבולת היטב. הוסף 4 טיפות של ריאגנט המצע 2 עד טריס חיץ, מערבולת היטב. הוסף 4 טיפות של ריאגנט המצע 3 עד טריס חיץ, מערבולת היטב. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS הנותרים למחוק את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של הפתרון צבע היטב כל הצלחת באמצעות רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור לאחר 5 עד 10 דקות של צבע מתפתחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ריאגנטים צבע להישאר על הצלחת עד הכתמים מתחילים להפוך סגולים כהים למדי. זה אמור לקחת בין 5 עד 20 דקות. להיזהר לא להשאיר את פתרון המצע על יותר מדי זמן, כי כך עלול לגרום רקע גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת ELISPOT 3 פעמים עם מי ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו לייבוש למשך כשעה או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו צלחת ידנית או עם קורא צלחת ELISPOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצלחת בקופסה הרחק חשיפה לאור. </li></ol> נציג תוצאות: ELISPOT נועדה לכמת את התגובה החיסונית נגד אנטיגנים של חיידקים. כל נקודה מציין התא מגיב אחד, המבטא את ציטוקינים של עניין. הכתמים ניתן לספור ידנית או באמצעות קורא צלחת ELISPOT. הערכה כי ELISPOT שבוצעה כהלכה צריך להתחיל עם החקירה של שליטה שלילי לייצור הרקע של ציטוקינים של עניין. ב בארות בקרה שלילית שהיינו מצפים לראות שום כתמים, אם כי קצת רקע (צבע סגול) רשאי להיות נוכח. בדרך כלל, לא צריך להיות פחות מהממוצע של חמש נקודות לכל טוב. בארות בקרה חיובית לאשר את התגובה שבוצעה כהלכה, וכי התאים מגיבים לגירוי antigenic. ב בארות בקרה חיובית שהיית מצפה לראות רקע סגול עמוק עקב מפגש של כתמים (Fig1). צריך להיות קצת רקע לא לבן. אם הביקורת חיובית דגימות בקרה שלילית מתאימים, אז אפשר לספור את בארות המכיל את האנטיגן של עניין. תוצאה &quot;לא טובים&quot;, יבואו לידי ביטוי על ידי רקע גבוה (בארות הם סגול), ללא כתמים או נקודות מעטים מאוד, מרכז ריקים, כתמים מוגדר כהלכה או כתמים ומחוברות. רשימה של עצות לפתרון בעיות מסופק (טבלה 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> באיור 1. נציג צלחת ELISPOT. כל צלחת צריכה להכיל ביקורת חיובית, שליטה שלילי פפטיד של עניין שנערך מינימום של שתי בארות. C9, C10, D10 ו - D9 הם בארות שליטה חיובית, כפי שניתן לראות יש צבע סגול עמוק, תאים ומחוברות וכמעט כל רקע לבן. בארות לשלוט שליליים G11, G12, H11 ו H12. בארות אלה אין רקע סגול ואין כתמים כצפוי. נקודות ה-G7, G8, H7 ו H8, ממחישות התגובות הסלולר פפטידים חיידקים; כתמים סגולים מייצגים תא תגובה אחת ביטוי ציטוקינים של עניין. טבלה 1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תצפית </td><td> בעיה אפשרית </td><td> פתרון אפשרי </td></tr><tr><td> גבוהה רקע </td><td> 1. שני הצדדים של הממברנה לא נשטף כראוי 2. יותר מדי תאים מפרישים ציטוקינים 3. פלייט לא מיובש כראוי 4. מעל צלחת שפותח </td><td> 1. שטפו את שני הצדדים של הממברנה עם מים מזוקקים לפני ואחרי התפתחות הצבע. ריאגנטים עלול לדלוף דרך הממברנה לתוך הבסיס של הבסיס, אלה יכולים לגרום רקע גבוה אם לא נשטף. 2. הפחת את מספר התאים בכל טוב, זה יחייב אופטימיזציה 3. יבש את הצלחת עוד לפני קריאת 4. לצמצם את זמן פיתוח </td></tr><tr><td> אין נקודות / כתמים מעטים </td><td> 1. לא מספיק תאים מפרישים ציטוקינים / חלבון עניין 2. ודא תאים מגורה בצורה נכונה 3. תאים לא מודגרות עבור lאונג מספיק או עלול לקחת זמן להגיב ממריץ 4. צבע לקוי פיתוח 5. לא מספיק ראשוני או משני הנוגדנים </td><td> 1. הגדלת מספר התאים. זה ידרוש אופטימיזציה 2. גם להשתמש בקרה גירוי חיובי - ממריץ שאתה יודע יניעו ביטוי של ציטוקינים שלך / חלבון עניין 3. להגדיל את זמן הדגירה התא או להשתמש בשיטה עקיפה (טרום לטפל בתאים עם ממריץ) 4. צג התפתחות צבע עם מיקרוסקופ תקורה להבטיח כי ריאגנטים בפיתוח אוחסנו כראוי ולא איבדו את פעילות 5. ריכוז הנוגדן העיקרי ו / או משנית יהיה צורך מוגבר. זה ידרוש אופטימיזציה. </td></tr><tr><td> בלנק תחומי </td><td> 1. ממברנה לא טרום טיפול 2. ממברנה התייבש בשלב כלשהו 3. תאים מופצים בצורה לא אחידה </td><td> 1. ודא קרום הוא pretreated כראוי עם אתנול 70% (ממברנות כל לא צריך את זה כדי לבדוק עם הספק שלך). לשטוף היטב עם PBS 3X לאחר מכן 2. ודא קרום לא יבש 3. ודא שאתה לערבב בעדינות את התאים יש השעיה תא הומולוגיים טוב לפני pipetting אל הבארות </td></tr><tr><td> בלנק מרכז </td><td> 1. נזקי כביסה </td><td> 1. ספיקה על מכונת כביסה אוטומטיים (או pipetting) עשוי להיות גבוה מדי. זקוק הליך כביסה עדינה יותר </td></tr><tr><td> שקר חיובי </td><td> 1. נוגדן אגרגטים משני 2. תאים עדיין על הממברנה 3. תרבית תאים זיהום </td><td> 1. סינון נוגדנים משני 2. ודאו כי כל התאים נשטפים מן הקרום עם PBS Tween 20 לפני הדגירה נוגדנים משני. תאים משמאל על הממברנה ייתן כתמים בצורת סדיר 3. שמור ריאגנטים כמו סטרילי ונקי ככל האפשר. ודא תרבות הסלולרי שלך הטכניקה aseptic. בדוק חיוביות שגויות על ידי הפעלת שליטה בתקשורת שלילית. עבור התנועה צלחת, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">לראות כתמים מוגדרים היטב</a> </td></tr><tr><td> ומחוברות כתמים </td><td> 1. ציפוי המסכן, נוגדן רב מדי 2. תא ממושכת תרבות 3. תאים מעל מגורה </td><td> 1. הפחתת ריכוז נוגדן ראשוני 2. ככל התאים מודגרת יותר, ציטוקינים / חלבון הם מפרישים. זה יגרום כתמים גדולים יותר יתחילו להתמזג ולהיות נבדל. 3. הפחת תרבית תאים צעד זמן הדגירה. גירוי יתר תגרום הרבה ציטוקינים / חלבון להיות מופרש על ידי התא. זה יהיה לייצר כתמים כי יתחילו להתמזג ולהיות נבדל. הפחת את כמות ממריץ בתקשורת תרבות או תרבות בסכום זמן קצר יותר </td></tr><tr><td> לא מוגדרים כתמים </td><td> 1. ממברנה לא טרום טיפול (אם הקרום שלך דורש את זה, לבדוק עם הספק) 2. פלייט תנועה במהלך הדגירה התא </td><td> 1. קרום חייב להיות מראש שטופלו אתנול או זה יכול לגרום, כתמים מטושטשים מוגדרים היטב. זה יהיה קשה לקורא להבחין בין אלה 2. אל תאפשר הצלחת להעביר במהלך הדגירה התא כמו תאים עברו תיצור יותר מאשר נקודה אחת. אם אפשר להשתמש חממה ייעודית כי לא ייפתחו במהלך הדגירה. אל הברז צלחת לאחר הוספת תאים </td></tr><tr><td> חיובי בקרה בארות נמוך </td><td> 1. נחשלות - עלול להיות תוצאה של שימוש streptavidin-ALP ו / או BCIP / NBT פתרונות שלא הובאו לטמפרטורת החדר </td><td> 1. תביאו ריאגנטים לטמפרטורת החדר לפני שמוסיפים את הבארות </td></tr><tr><td> צפיפות נקודות מקשה לכמת אותם </td><td> 1. תאים רבים מדי נוספו הבארות </td><td> 1. הפוך את דילולים של תאים (כלומר, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 תאים לכל טוב) כדי לקבוע את המספר האופטימלי של התאים תגרום להיווצרות כתמים ברורים </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay ELISPOT התפתחה כאחד מבחני החשוב ביותר בשימוש נרחב כדי לפקח על המערכת החיסונית בבני אדם וכן מגוון של מינים אחרים. עם assay ELISPOT, תדרים תא החיסון ניתן למדוד ברמת תא בודד ללא הרחבה או מניפולציה של אוכלוסיות תאים. Assay ELISPOT הוחל נרחב לחקור ספציפית אנטיגן התגובה החיסונית במחלות...

א הכנת מדיה <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="חומרים" /> ב הכנת מאגר טריס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 800 מ&quot;ל של DDH 2 O ל L 1 כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 12 גרם של טריס ומוסיפים כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף hexahydrate 0.12 גרם של מגנזיום כלוריד (MgCl 2: 6 שעות 2 O) לתוך כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עם מוט בחישה מגנטי על צלחת ערבוב אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מומס, pH 9.5 הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 200 מ&quot;ל של DDH 2 O ל כוס, מביאים אותו עד 1000mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li></ol> ג חומרים הדרושים לניתוח ELISPOT: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="חומרים ב" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

חסינות מסתגלת היא מרכיב חשוב אישור של פתוגנים תאיים. היכולת לזהות ולכמת התגובות הללו בבני אדם הוא כלי אבחוני חשוב. Assay enzyme-linked immunospot (ELISPOT) הוא צובר פופולריות ביכולתה לזהות התגובה החיסונית התאית נגד אנטיגנים של חיידקים, כולל אוכלוסיות immunosuppressed כגון אלה עם HIV, השתלה, ואת השימוש בסטרואידים. Assay זה יש את היכולת לכמת את התגובה החיסונית נגד אנטיגנים ספציפיים של חיידקים, כמו גם להבחין אם התגובות האלה Th1 או Th2 אופי. ELISPOT אינה מוגבלת לאתר של דלקת. זה צדדי ביכולתה להעריך את התגובה החיסונית בתוך דם היקפיים, כמו גם אתרים של מעורבות פעילה כגון שטיפה ברונכואלוואולרית, נוזל השדרה מוחין, מיימת. זיהוי של המערכת החיסונית כנגד אנטיגנים בודדות או מרובות אפשרי, כמו גם epitopes חלבונים ספציפיים בתוך חיידקים. Assay זה מאפשר זיהוי של המערכת החיסונית לאורך זמן, כמו גם הבחנות מוכר על ידי אנטיגנים לתאי T הפונדקאי. Dual ELISPOT מבחני צבע זמינים עבור גילוי של ביטוי סימולטני של שני ציטוקינים. יישומים אחרונים של טכניקה זו כוללים אבחנה של שחפת extrapulmonary, כמו גם חקירה של התרומה של אנטיגנים זיהומיות למחלות אוטואימוניות.

Watch this Scientific Journal Video about Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens at JoVE.com

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.

Video: Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות לשפעת המופילוס

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...