פרוטוקול זה יכול לספק לחוקרים אחרים גישות ניסוייות ישירות ויעילות ואת הצעדים המפורטים להערכת יעילות התגובה התאית של אדג'ובנטים חדשניים לחיסונים. הוא אינו יכול רק לספק לחוקרים שיטות ספציפיות להערכה תאית עבור אדג'ובנטים, אלא יכול גם לפרק שיטות מיצוי כגון מחלת BM. פרוטוקולים אלה לא רק שאינם מדגימים רעילות ואספקה תאית גבוהה, אלא גם מספקים נהלים מפורטים לתחום ההערכה האדג'ובנטית.
כדי להתחיל, הפעל את אמבט המים והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. ואז לאחר איסוף צינור של תאי L929 קפואים מחנקן נוזלי, להפשיר במהירות באמבט המים. לאחר שהכניסו את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר, הוסיפו שני מיליליטר DMEM וערבבו היטב.
צנטריפוגה את הדגימות ב 129 x גרם במשך חמש דקות. ולאחר השלכת supernatant, להוסיף שני מיליליטר של DMEM כדי להשעות את התאים. צנטריפוגה את הדגימות שוב.
ולאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו שישה מיליליטרים של DMEM מדיום שלם לחידוש מחדש, והעבירו לבקבוקון תרבית בריבוע T25 סנטימטר בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לתרבית למשך 48 שעות. ביום ה-24 לאחר החיסון הראשוני, מוציאים את העכברים מחדר החיות, מניחים אותם בכלי זכוכית ומשרים ב-75% אלכוהול למשך חמש דקות. הניחו את צינורות הצנטריפוגה על מתלה צינורות צנטריפוגה, ספרו את צלחות הפטרי החד פעמיות, והוסיפו חמישה מיליליטר של PBS לכל צלחת פטרי עם פיפטה של 10 מיליליטר.
בצע חתך של שישה עד שמונה סנטימטרים עם מספריים באמצע הצד הגחוני השמאלי של העכבר. יש לקרוע את העור כדי לחשוף את דופן הבטן ולאתר את הרצועה האדומה הארוכה של הטחול. לאחר מכן, להרים את הצפק בצד התחתון של הטחול עם מלקחיים.
חותכים אותו פתוח והופכים אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את הטחול. מרימים את הטחול עם מלקחיים. להפריד את רקמת החיבור מתחת לטחול עם מספריים עיניים ולהסיר את הטחול.
מניחים את הטחול בצלחת פטרי המכילה חמישה מיליליטר של PBS וטחנה עם מסננת ובוכנה מזרק. לאחר שחיקה, להעביר את הנוזל לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר עם פיפטה בהתאם למספור. לאחר מכן, צנטריפוגה את הנוזל ב 453 x גרם במשך חמש דקות.
ולאחר השלכת supernatant, להוסיף שלושה מיליליטר של תזה תאי דם אדומים חיץ לכל צינור. יש להשעות את התאים ולהניח אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 10 עד 12 מיליליטר של PBS לכל צינור.
ולאחר ערבוב צנטריפוגה ב 453 x גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS לכל צינור צנטריפוגה להשעות את התאים. קח 20 מיקרוליטרים של כל דגימה בבאר של צלחת ספירת התאים ותעד את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב 453 x גרם במשך חמש דקות.
ולאחר השלכת הסופרנטנט, יש לדלל ל-2.5 על 10 לתאים השישיים למיליליטר עם מדיום RF10 ולהוסיף לצלחת של 96 באר ב-100 מיקרוליטר לבאר. חותכים חתך של שישה עד שמונה סנטימטרים מתחת לבטן העכבר במספריים ומהדקים את שני קצוות הפתח כדי להפריד אותו לכיוונים שונים ולחשוף את רגלי העכבר. הפרד את עצם הירך של העכבר מגוף העכבר ואת השוקה מהמפרק.
ולשמור על העצמות שלמות בשני הקצוות. לאחר מכן, להסיר את הרקמה שיורית וסחוס מן המפרקים המפרקים בשני הקצוות של עצם הירך עם מספריים ומלקחיים. השרו את עצם הירך ב-75% אלכוהול למשך חמש דקות ולאחר מכן השרו בתמיסת PBS סטרילית כדי לשטוף את האלכוהול שעל פני השטח.
ואז לחתוך את הקצוות של עצם הירך עם מספריים ולשטוף את מוח העצם בצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת PBS סטרילית, ואחריו שאיפה עם מזרק מיליליטר אחד. חזרו על הכביסה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן, סננו על ידי מסננת תאים ואספו את התאים הדנדריטיים שמקורם במח העצם לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.
לאחר צנטריפוגה של הדגימות ב 290 x g במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולהוסיף ארבעה מיליליטר של חיץ תזה תאי דם אדומים, ressuse ו lyse בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת PBS סטרילית כדי לנטרל את ליזאט, ולאחר צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant. יש לתלות את התאים במיליליטר אחד של DMEM המכיל תמיסת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי ולספור.
לאחר מכן הוסיפו גורם מגרה של מושבת גרנולוציטים מקרופאגים בתוספת אינטרלוקין-4 למדיום. התאם את ריכוז התאים ל-5 x 10 למיליליטר וחסן את התאים על גבי תלושי כיסוי. לאחר הוספת תרחיף התא לצלחת של שש בארות בשני מיליליטר לבאר, מניחים את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.
שנה את המדיום לחלוטין לאחר יומיים ושנה מחצית מהמדיום לאחר ארבעה ימים. טבלו את העכברים ב-75% אלכוהול לאחר המתת חסד והניחו אותם עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי מזכוכית בסדר ממוספר. העבירו את העכברים דרך חלון ההעברה לחדר הניתוח הסטרילי והניחו אותם על שולחן הניתוחים למשך חמש דקות.
באמצעות מזרק, לשאף 10 מיליליטר של מלוחים. הטו את העכברים כלפי מטה בטמפרטורה של כ-45 מעלות והזריקו למרכז חלל הבטן. למשוך כחמישה מיליליטר של השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר עבור כל 10 מיליליטר ולחזור על ההזרקה שלוש פעמים.
צנטריפוגה של מתלה התא ב 129 x גרם במשך חמש דקות כדי לקבל מקרופאגים ראשוניים הצפק של העכבר. פיברובלסטים L929 הם מודל סינון שימושי לבדיקת רעילות במבחנה של NOD. כימות רמות הציטוקינים הדלקתיים בטחול יכול לסייע לחוקרים להבין טוב יותר את התגובה החיסונית.
ניטור לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T עם אימונוספוט הקשור לאנזימים הוא תקן הזהב להערכת חסינות תאי T ספציפיים לאנטיגן בניסויים קליניים ולסינון מועמדים לחיסונים. הספיגה המוגברת של אנטיגן על-ידי תאים דנדריטיים יכולה לעורר תגובות חיסוניות נרכשות משופרות. מקרופאגים ממלאים תפקיד חשוב בהצגת אנטיגנים לתאי T, כמו גם בגרימת תאים אחרים המציגים אנטיגן לבטא מולקולות ממריצות משותפות, ובכך ליזום תגובות חיסוניות נרכשות.
בידוד התאים תחת היחס בין פעולה של תרופה לתא הם בעלי חשיבות עליונה.
