עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01-R01 HL70393 ו-NS060706 כדי JCJC הוא פרופסור להנדסה ביו רפואית על ט ספנסר אולין הקרן.

1. הזרקה לתוך ביציות של mRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק .05-50 ng RNA שליח שהיה עיבד במבחנה לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) באמצעות Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (דראמונד מדעי החברה, מודל 3-000-204). חזור על זריקה על עשרות ביציות עבור כל ה-mRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ביציות מוזרק פעמיים באמצעות ND-96 הפתרון (96 mM נתרן כלורי (NaCl, מר 58.44 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, מר 74.56 g / mol), 1.8 mM סידן כלורי (CaCl 2 • 2H 2 O מר 147.02), 1 mM מגנזיום כלורי (MgCl 2 • 6 שעות 2 O, מר 203.31 g / mol), 5 מ&quot;מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, מר 238.31 g / mol), 2.5 מ&quot;מ pyruvate נתרן (מר 110.04 g / mol), ו-1x פניצילין סטרפטומיצין. pH 7.6), ואז למקם אותם בצלחת תרבות לדגור על 18 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים +. </li></ol> 2. הכנת מערכת זלוף <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור של מערכת ValveLink 16 זלוף לאוטומטי. המערכת משתמשת זלוף חנקן דחוס כדי לדחוף פתרונות זלוף מתוך המאגרים פתרון, דרך tubings זלוף, וכדי העיפרון זלוף ועל קצה. הזרימה של כל זרם של פתרון זלוף נשלט על ידי שסתום חד המאגר ואחד שסתום אלקטרוני. בפרוטוקול זה, אחד המאגרים לא בלחץ פונקציות כאספן פסולת, כמו גם מנגנון שחרור הלחץ. (תמונה מותאמת http://www.autom8.com באתר האינטרנט של הספק) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את tubings על העיפרון זלוף. הפעל את הבקר שסתום אלקטרוני לפתוח את שסתומי אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח כי tubings ואת עפרון זלוף חופשיים של בועות לסתום ואוויר, לדחוף מים deionized (di) דרך כל צינורות באמצעות מזרק מלא מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את tubings אל המאגרים פתרון ולפתוח את שסתום הגז גליל ליישם חנקן דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתום מאגר למלא את צינורות עם פתרון המאגר. פליק שסתום מאגר להסיר בועות פתרון במידת הצורך. סגור את שסתום לאחר בצינור מלא פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את קצה זלוף עם מים לדפוק אותו על העיפרון זלוף. היזהרו שלא להשמין כל הבועות בעת חיבור קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העיפרון זלוף לשלב אמבט באמצעות פלסטלינה. ודא את קצה זלוף הוא בחלל אמבטיה. המערכת זלוף מוגדר כעת למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים DI באמבטיה. ודא את קצה זלוף הוא שקוע בתוך המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה כי כל פתרון זלוף יוצא קצה זלוף כראוי. סגור את שסתום אלקטרוני המחובר בצינור של אספן פסולת לפתוח את שסתום עבור פתרון אחד זלוף בכל פעם (140 mM אשלגן הידרוקסיד (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 מ&quot;מ 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, M r 74.56 g / mol), 1 אתילן גליקול mM-bis (2-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;- tetraacetic חומצה (EGTA, M r 380.35 g / mol), pH מותאם 7.1-7.2 methanesulfonic על ידי חומצה (Meso 3, M r 96.1 g / mol), Ca 2 + או Mg2 + מתווסף הריכוז הרצויה בעת הצורך). תחת מיקרוסקופ, לבחון את סילון של נוזל זלוף יוצא קצה זלוף. סגור את שסתום לפתרון זלוף ולפתוח את שסתום עבור אספן הפסולת. סילון זלוף צריך כמעט נעלמים. חזור על בדיקה דומה עבור כל הפתרונות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שווידאת כי כל הפתרונות זלוף זרימה נכונה, להחליף מים DI באמבטיה עם פתרון אמבטיה (140 mM אשלגן הידרוקסיד (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 מ&quot;מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, M r 74.56 g / mol), pH מותאם 7.1-7.2 methanesulfonic על ידי חומצה (Meso 3, M r 96.1 g / mol)). </li></ol> 3. תיקון Clamping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות מחדש את האלקטרודה הקלטה Ag עם AgCl לפני תיקון כל clamping הפגישה. ראשית, להסיר את חוט האלקטרודה מבעל פיפטה ו לצלול חצי קצה חוט האלקטרודה בבקבוקון המכיל אקונומיקה טרי במשך לפחות 15 דקות. פיקדונות זו שכבה של AgCl על חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את חוט האלקטרודה במים deionized ואת כתם יבש. ואז להתקין את אלקטרודת Ag / AgCl חזרה לבעל פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה (הפניה) אמבטיה על headstage ולמקם אותו באמבטיה. זה מכין את האלקטרודות הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להתכונן רכישת נתונים. הפעל את המחשב וחבר את מפתח חומרה ליציאת המדפסת של המחשב. המפתח החומרה חייב להיות מחובר כדי שתוכל להשתמש בתוכנה נתונים הרכישה, אשר HEKA הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המגבר (אקסון מכשירים, AXOתיקון 200B) ולהתחיל HEKA דופק. טען את קובץ פרוטוקול ולהתאים את הגדרות התצורה, כגון סולם הגירוי. המטרה של התאמת הגדרות התצורה היא להבטיח כי פוטנציאל הבדיקה הוא שווה בדיוק פוטנציאל הפקודה. זה מכין את הציוד רכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ביציות. הביצית לצלול בפתרון הפשטת (200 mM N-methyl-D-glucamine (NMG, M r 195.22 g / mol), Aspartate 200 מ&quot;מ (לא K +) (M r 133.1 g / mol), אשלגן כלורי 2 מ&quot;מ (KCl , מ r 74.56 g / mol), 10 אתילן גליקול mM-bis (2-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;-tetraacetic חומצה (EGTA, M r 380.35 g / mol), 1 mM מגנזיום כלורי (MgCl 2 • 6 שעות 2 O, M r 203.31 g / mol), 10 מ&quot;מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), pH מותאם על ידי 7.4 סודיום הידרוקסיד (NaOH, M r 40.0 g / mol) במשך 5 - 10. min הפתרון הפשטת מנתק את קרום vitelline מן הקרום פלזמה המאפשר להפשיט את קרום vitelline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות רצועת קרום vitelline מן הביצית באמצעות שני זוגות מלקחיים. הביצית devitellinized היא שברירית מאוד, ולכן יש להעביר מעט ככל הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול למניעת חשיפת הביצית devitellinized אוויר או בועות, השתמש פיפטה זכוכית מלאים פתרון מספיק כדי להעביר את הביצית לאמבטיה. זה מכין את הביצית הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pipettes התיקון. משוך את pipettes זכוכית לאחר החדרת צינור זכוכית נימי (VWR הבינלאומי, חתול # 53432-921) לתוך סאטר P-97 Flaming / בראון micropipette פולר. שים לב pipettes תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את צורת קצה וקוטרו הפתיחה. קוטר הפתח צריך להיות 2-4 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את זרם קיבולי במהלך ההקלטה ולהבטיח טיפ מעיל חלקה, קצה בשעווה ואחר האש ללטש אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את קצה פיפטה ידי הצבת קצה פיפטה בתוך הפתרון פיפטה (140 mM אשלגן הידרוקסיד (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 מ&quot;מ 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES, M r 238.31 g / mol), 2 mM אשלגן כלורי (KCl, M r 74.56 g / mol), 2 mM מגנזיום כלורי (MgCl 2 • 6 שעות 2 O, M r 203.31 g / mol), pH מותאם 7.1-7.2 ידי methanesulfonic חומצה (Meso 3, M r 96.1 g / mol)) וציור על הבוכנה. זה מרטיב את קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה 1 / 3 מלא עם פתרון פיפטה בעזרת מזרק המקום פיפטה של ​​בעל פיפטה עם בתוך Ag / AgCl את האלקטרודה ויצירת קשר עם פתרון פיפטה. זה מכין את פיפטה התיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הבלו תיקון מבפנים החוצה מן הביצית מוכנה, למצוא את קצה ברורה של הביצית תחת מיקרוסקופ. הזז את פיפטה תיקון קרוב הביצית באמצעות מניפולטור. שיא ההתנגדות הטורית של טפטפת. ההתנגדות סדרת האידיאלי של פיפטה את התיקון הוא בין 1-1.5 MΩ כאשר התמלאו פתרון פיפטה ו שקוע בפתרון אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לדחוף את פיפטה נגד הביצית עד ההתנגדות כ מכפיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל יניקה עדין הממברנה דרך הפה דרך צינור אשר מחובר למחזיק פיפטה עד חותם גיגה אוהם מתקבל. לייצב את התיקון על ידי מחזיק אותו במתח -30 mV במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג מבפנים החוצה, בלו התיקון על ידי תיקון במהירות דוחפים את פיפטה נוספת לתוך הביצית, ואז משיכתו בעדינות החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התיקון מבפנים החוצה מוכן כעת clamping. הזז את פיפטה מחזיקה את התיקון מבפנים החוצה כ 100 מיקרון הרחק פתיחת קצה זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את שסתום אלקטרוני לאיסוף פסולת לפתוח את שסתום מאגר לפתרון הרצוי זלוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הקלטה זרמים על פני תיקון. שנה את מתח זלוף פתרונות כרצונכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תסיים להקליט, לנקות את tubings זלוף, עיפרון על ידי דחיפת קצה דרך המים deionized להימנע כפכפים. </li></ol> 4. נציג תוצאות במהלך הכנת ביציות עבור מהדק תיקון, הטיפול 50-10 דקות של פתרון הפשטת היה לנתק את קרום vitelline מן הקרום פלזמה, אשר מאפשר הפשטת הממברנה vitelline. ההתנגדות סדרת האידיאלי של פיפטה את התיקון הוא בין 1-1.5 MΩ כאשר התמלאו פתרון פיפטה ו שקוע בפתרון אמבטיה. להלן נציג הקלטה של ​​wild-type ערוצי BK על תיקון קרום הביצית. בפינה השמאלית העליונה, גלי רבוע מצביעים על מתח להחיל את התיקון - השלב השני של עליות מתח מ mV 50 עד mV 200 עם תוספת של 50 mV. להלן עקבות הנוכחית המקביל כאשר הפתרון זלוף יש הנומינלי 0 Ca 2 + (חינם [Ca 2 +] הוא כ 0.5 ננומטר). בקמט של משרעת הנוכחי עולה כי ההסתברות לפתוח ערוצי BK עולה עם מתח. בצד ימין, התיקון אותו הוא perfused עם 1.0 מיקרומטר Ca 2 + כאשר מיישמים מתח עם פרוטוקול זהה. משרעת הנוכחי מגדיל יותר תחת מתח אותו, המציין את ההסתברות פתוח עולה עם [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="איור 2" />

<ol>
	<li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes:+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels.">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pfl&#252;gers Arch. 407, 577-588 (1986).</li><li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maxi-K+(Ca),+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily.">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li><li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+cell+tuning.">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li><li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder.">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li><li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone.">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li><li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family.">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li><li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mg2++enhances+the+function+of+BK-type+Ca2+-activated+K++channels.">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li><li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+mechanism+of+BK+(Slo1)+channels:+so+near,+yet+so+far.">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li><li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conductance+Ca2+-activated+K++(BK)+channel:+activation+by+Ca2++and+voltage.">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li><li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K++channel.">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li><li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2+-dependent+activation+of+BK-type+mslo1.">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li><li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2++coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1.">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li><li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term={beta}+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia.">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מערכת ביטוי הביצית הוא אידיאלי עבור אפיון אלקטרו של מתח תלויי תעלות יונים בשל הרקע נמוך יחסית של ערוצי אנדוגני. יתר על כן, מכיוון שמדובר במערכת ביטוי חולף, הוא מספק שיטה יעילה של ביצוע מחקר mutagenesis הערוצים הללו. עם זאת, ראוי לציין כי מערכת ביטוי הביצית שונה מזו בתאי יונקים, ולכן ייתכנו הבדלים שינוי שלאחר translational ו בשיתוף עם יחידות משנה שונות. יתר על כן, ריכוז השומנים עשוי להיות שונה בין שני תאים אשר עשויים להשפיע על מאפיינים פונקציונליים של הערוץ. Tubings זלוף, עיפרון קצה יש לנקות עם מים DI בכל פעם לאחר הניסוי, כדי למנוע לסתום. השתמש תמיד טרי אקונומיקה לטפל חוט אלקטרודת Ag כדי לוודא שהוא מצופה AgCl, הקלטה אחרת יהיה לא מדויק. התאם את הגדרות התצורה עבור רכישת נתונים, כך פוטנציאל הבדיקה הוא שווה בדיוק פוטנציאל הפקודה. זה יעזור לשמור על pipettes תיקון כל כך נקי להשתמש במכסה כדי להגן עליהם מפני לכלוך אש רק ללטש אותם לפני השימוש.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion System and Electronic Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutoMate Scientific, Inc.</td>
<td>ValveLink 16</td>
<td>Inner diameter of perfusion tip: 100 microns</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>CKX31</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>AXOPATCH 200B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer Interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>INSTRUTECH Corporation</td>
<td>ITC-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>CV 203BU</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes

הפרוטוקול המובא כאן נועד לבחון את הפעלת מוליכות גדול, מתח ו-Ca 2 + המופעל K + (BK) ערוצים. הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי ללמוד את מערכת היחסים מבנה פונקציה תעלות יונים אחרים קולטני הנוירוטרנסמיטר 1. ערוצי BK באים לידי ביטוי נרחב ברקמות שונות היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיים רבים, כולל ויסות התכווצות שרירים חלקים, כוונון תדר של תאים שיער הפנימי הסדרת שחרור הנוירוטרנסמיטר 2-6. ערוצי BK מופעלים על ידי שלילת קוטביות הממברנה ועל ידי תאיים Ca 2 + ו - Mg 2 + 6-9. לפיכך, הפרוטוקול נועד כדי לשלוט הן את מתח הממברנה והפתרון תאיים. בפרוטוקול זה, RNA שליח של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) ואחריו 2-5 ימי דגירה על 18 ° C 10-13. תיקוני ממברנה המכילות אחד או מספר ערוצים BK הם נכרת עם תצורה בתוך-out באמצעות מהדק תיקון טכניקות 10-13. הצד תאיים התיקון הוא perfused עם פתרונות הרצוי במהלך ההקלטה, כך הפעלת הערוץ בתנאים שונים ניתן לבדוק. לסיכום, ה-mRNA של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis להביע ערוץ חלבונים על קרום הביצית, מהדק טכניקות תיקון משמשים שיא זרמים הזורמים בצינורות תחת מתח מבוקר פתרונות תאיים.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes at JoVE.com

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי ביטוי<em&gt; Xenopus ביציות</em&gt; על ידי הזרקת RNA שליח. הפתרון תאיים במהלך הקלטות מהדק תיקון נשלטת על ידי מערכת טפטוף.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

20.8K Views.  Washington University in St. Louis. יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי ביטוי Xenopus ביציות על ידי הזרקת RNA שליח. הפתרון תאיים במהלך הקלטות מהדק תיקון נשלטת על ידי מערכת טפטוף.

Video: Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...