وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - R01 - HL70393 وNS060706 لJCJC هو أستاذ الهندسة الطبية الحيوية بشأن الوقف سبنسر أولين T..

1. حقن مرنا في البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 0،05-50 نانوغرام رسول الحمض النووي الريبي التي تم نسخها في البويضات في المختبر المورق القيطم (V - المرحلة السادسة) باستخدام Nanoject الثاني التلقائي نانولتر الحاقن (دروموند الشركة العلمية ، ونموذج 3-000-204). تكرار الحقن على البويضات عشرة لكل مرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف البويضات باستخدام حقن مرتين ND - 96 حل (96 ملي مول كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، والسيد 58.44 غرام / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، السيد 74.56 غرام / مول) ، و 1.8 ملي مول كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 • 2H 2 O السيد 147.02) (1) ، كلوريد المغنيسيوم ملم (MgCl 2 • 6H 2 O ، والسيد 203.31 غ / مول) ، 5 مم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES السيد 238.31 غ / مول) ، و 2.5 ملي البيروفات الصوديوم (السيد 110.04 غ / مول) ، والبنسلين 1X - الستبرتوميسين. الهيدروجيني 7.6) ، ثم ضع عليها في لوحة الثقافة واحتضان عند 18 درجة مئوية لمدة أيام + 2. </li></ol> 2. إعداد نظام الإرواء <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> التوضيح للنظام أتمتة ValveLink الارواء 16. نظام الارواء يستخدم النيتروجين الضغط لدفع الحلول نضح من الخزانات الحل ، من خلال شبكة أنابيب التروية ، وقلم رصاص ونضح طرف. يتم التحكم في تدفق تيار من كل حل الارواء بواسطة صمام خزان واحد وصمام الالكترونية. في هذا البروتوكول ، واحدة من الخزانات ليست مضغوطة ووظائفها ، وهواة جمع النفايات ، فضلا عن آلية الضغط الافراج عنهم. (صورة مقتبسة من موقع http://www.autom8.com البائع) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الأنابيب إلى قلم الارواء. بدوره على وحدة تحكم إلكترونية وصمام فتح الصمامات الالكترونية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتأكد من أن الأنابيب وقلم نضح خالية من فقاعات الهواء وتسد ، ودفع منزوع الأيونات (DI) أنابيب المياه من خلال استخدام كل حقنة مملوءة بالماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الأنابيب إلى الخزانات الحل وفتح صمام اسطوانة غاز النتروجين لتطبيق الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صمام لملء خزان الأنبوب مع الحل الخزان. نفض الغبار صمام خزان لإزالة الفقاعات في الحل إذا لزم الأمر. إغلاق صمام بعد ملء الأنبوب مع الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء غيض نضح بالماء والمسمار وضعها على اللوحة ، قلم من نضح. يجب الحرص على عدم اعتراض أي فقاعات عند توصيل معلومات سرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح قلم نضح إلى مرحلة استخدام حمام الطين النمذجة. تأكد من غيض نضح في مساحة الحمام. يتم الآن تعيين نظام نضح أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DI المياه في حوض الاستحمام. تأكد من الحافة المغمورة نضح في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كل حل نضح يخرج من غيض نضح بشكل صحيح. إغلاق صمام الالكترونية متصلة أنابيب من هواة جمع النفايات وفتح صمام للحل نضح في وقت واحد (140 ملي هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH ، M ص 56.1 غرام / مول) ، و 20 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) -1 -- piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، 1 الايثيلين جلايكول ملي مكرر (2 - aminoethylether) - N ، N ، N &#39;، N&#39; - tetraacetic حمض (EGTA ، M ص 380.35 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 بواسطة حامض methanesulfonic (MESO 3 ، ص 96،1 م غ / مول) ، كا 2 + او + Mg2 إضافة الى التركيز المطلوب عند الحاجة). تحت المجهر ، ومراقبة الطائرة نضح السوائل التي تخرج من الطرف الارواء. إغلاق صمام حل نضح وفتح صمام لجمع النفايات. ينبغي أن تختفي طائرة نضح تقريبا. تكرار نفس الاختبار لجميع الحلول والارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يكون لديك التحقق من أن جميع الحلول نضح تدفق بشكل صحيح ، استبدال DI المياه في الحمام مع الحل حمام (140 ملي هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH ، M ص 56.1 غرام / مول) ، و 20 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 بواسطة حامض methanesulfonic (MESO 3 ، ص 96،1 م ز / مول)). </li></ol> 3. التصحيح المشبك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Recoat القطب تسجيل حج مع AgCl قبل كل التصحيح لقط الدورة. أولا ، ازالة الاسلاك الكهربائي من حامل ماصة ويغرق النصف غيض من السلك الكهربائي في قارورة تحتوي على مواد التبييض جديدة لما لا يقل عن 15 دقيقة. هذه الودائع طبقة من AgCl على السلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف السلك الكهربائي مع الماء منزوع الأيونات وصمة عار الجافة. ثم تثبيت القطب حج / AgCl الظهر في حامل ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل حمام (المرجع) إلى القطب headstage وضعه في حوض الاستحمام. تستعد هذه الأقطاب للتسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستعد الآن للحصول على البيانات. بدوره على الكمبيوتر والمكونات الرئيسية للجهاز في منفذ الطابعة من جهاز الكمبيوتر الخاص بك. يجب أن يكون مفتاح الجهاز موصول لك استخدام البرنامج للحصول على البيانات ، وهو HEKA النبض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مكبر للصوت (أكسون الصكوك الذخائر المتروكةPATCH 200B) وبدء نبض HEKA. تحميل ملف البروتوكول وضبط إعدادات التكوين ، مثل مقياس التحفيز. هدف لتعديل إعدادات التكوين هو أن أؤكد أن إمكانية اختبار تساوي بالضبط إمكانات القيادة. تستعد هذه المعدات الحصول على البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير البويضات. يغرق البويضة في حل تجريد (200 ملي N - ميثيل - D - glucamine (NMG ، M ص 195.22 غ / مول) ، 200 ملي الأسبارتات (لا K +) (M ص 133.1 غ / مول) ، وكلوريد البوتاسيوم 2 ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، و 10 ملي جلايكول الإثيلين مكرر (2 - aminoethylether) - N ، N ، N &#39;، N&#39; - tetraacetic حمض (EGTA ، M ص 380.35 غ / مول) ، 1 كلوريد المغنيسيوم ملم (MgCl 2 • 6H 2 O ، M ص 203.31 غ / مول) ، و 10 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7.4 بواسطة هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم ، M ص 40.0 غرام / مول) لمدة 5 -- 10 دقائق الحل تجريد يفصل الغشاء المحي من غشاء البلازما مما يجعل من الممكن لتجريد الغشاء المحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط برفق الغشاء المحي من البويضة باستخدام اثنين من أزواج من الملقط. والبويضة devitellinized هش للغاية ، ولذا ينبغي أن يكون كما تحركت قليلا عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الحرص على منع تعريض البويضة devitellinized فقاعات في الهواء ، أو استخدم ماصة زجاجية مملوءة بمحلول بما فيه الكفاية لنقل البويضة إلى الحمام. تستعد هذه البويضة للتسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ماصات التصحيح. سحب الماصات الزجاج بعد إدخال أنبوب زجاجي الشعرية (VWR الدولية ، القط # 53432-921) في سوتر P - 97 يلهب / براون Micropipette بولير. مراقبة ماصات تحت المجهر لتحديد شكل نصيحة وقطر الافتتاح. ينبغي أن يكون قطرها افتتاح 2-4 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالسعة الحالية للحد من خلال تسجيل ولضمان سلاسة الحافة ، ومعطف غيض بالشمع ثم البولندية النار عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء غيض من خلال وضع ماصة غيض من ماصة داخل حل ماصة (140 ملي هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH ، M ص 56.1 غرام / مول) ، و 20 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، M ص 238.31 غ / مول) ، 2 كلوريد البوتاسيوم ملم (بوكل ، م ص 74،56 غ / مول) ، 2 كلوريد المغنيسيوم ملم (MgCl 2 • 6H 2 O ، M ص 203.31 غ / مول) ، ويتم تعديل درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 بواسطة methanesulfonic حمض (MESO 3 ، ص 96،1 م ز / مول)) والرسم الغطاس. هذا غيض يبلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ماصة 03/01 الحل الكامل مع ماصة باستخدام محقنة ووضع ماصة في حامل ماصة مع قطب كهربائي داخل حج / AgCl والاتصال مع الحل ماصة. يعد هذا ماصة التصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستئصال رقعة من الداخل إلى الخارج من بويضة أعدت ، العثور على حافة واضحة من البويضة تحت المجهر. نقل ماصة التصحيح قريب من البويضة باستخدام مناور. سجل المقاومة التسلسلي للماصة. المقاومة سلسلة المثالي للماصة التصحيح بين 1-1،5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة والغارقة في حل الحمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع ببطء ماصة ضد المقاومة البويضة حتى يتضاعف تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طيف الامتصاص للغشاء عن طريق الفم من خلال أنبوب الشفط الذي يرتبط حامل ماصة حتى يتم الحصول على ختم GIGA أوم. استقرار التصحيح بوضعها في بالسيارات -30 الجهد لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على التصحيح من الداخل إلى الخارج ، المكوس التصحيح عن طريق دفع بسرعة ماصة الى مزيد من البويضة ثم يسحب للخارج برفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصحيح من الداخل إلى الخارج هو الآن على استعداد للقط. نقل ماصة عقد التصحيح من الداخل إلى الخارج لحوالي 100 ميكرون بعيدا عن افتتاح قمة الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق صمام الالكترونية لجمع النفايات وفتح صمام خزان من أجل حل نضح المطلوب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التسجيل عبر التيارات التصحيح. تغيير الحلول الجهد ونضح على النحو المرغوب فيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من التسجيل ، تنظيف الأنابيب التروية ، وغيض من رصاص عن طريق دفع المياه من خلال منزوع الأيونات لتجنب السدادات. </li></ol> 4. ممثل النتائج أثناء إعداد البويضات لالمشبك التصحيح ، فإن العلاج 5-10 دقيقة من حل تجريد فصل الغشاء المحي من غشاء البلازما ، مما يجعل من الممكن تجريد الغشاء المحي. المقاومة سلسلة المثالي للماصة التصحيح بين 1-1،5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة والغارقة في حل الحمام. فيما يلي تسجيل ممثل قنوات BK من النوع البري على البويضة التصحيح الغشاء. في أعلى اليسار ، وموجات مربعة تدل على الجهد المطبق على التصحيح -- الخطوة الثانية من الزيادات الجهد من 50 فولت الى 200 فولت مع زيادة قدرها 50 بالسيارات. أقل من آثار المقابلة الحالي عندما حل ونضح الاسمية 0 كا 2 + (مجانا [كا 2 +] هو حوالي 0.5 نانومتر). في عامتجعد من السعة الحالية تشير إلى أن احتمال فتح قنوات BK يزداد مع الجهد. على الجانب الأيمن ، وperfused التصحيح نفسه مع 1.0 ميكرومتر كا 2 + عندما يطبق مع بروتوكول الجهد نفسه. السعة الحالية تزيد أكثر في إطار الجهد نفسه ، مشيرا الى ان احتمال فتح يزداد مع [كا 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="الشكل 2" />

<ol>
	<li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes:+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels.">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pfl&#252;gers Arch. 407, 577-588 (1986).</li><li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maxi-K+(Ca),+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily.">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li><li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+cell+tuning.">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li><li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder.">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li><li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone.">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li><li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family.">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li><li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mg2++enhances+the+function+of+BK-type+Ca2+-activated+K++channels.">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li><li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+mechanism+of+BK+(Slo1)+channels:+so+near,+yet+so+far.">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li><li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conductance+Ca2+-activated+K++(BK)+channel:+activation+by+Ca2++and+voltage.">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li><li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K++channel.">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li><li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2+-dependent+activation+of+BK-type+mslo1.">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li><li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2++coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1.">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li><li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term={beta}+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia.">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نظام التعبير البويضة مثالية لتوصيف الكهربية من القنوات ايون الجهد التي تعتمد على نتيجة لخلفية منخفضة نسبيا من القنوات المحلية. وعلاوة على ذلك ، لأنه هو نظام التعبير عابرة ، فإنه يوفر وسيلة فعالة لإجراء دراسة الطفرات لهذه القنوات. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن النظام ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion System and Electronic Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutoMate Scientific, Inc.</td>
<td>ValveLink 16</td>
<td>Inner diameter of perfusion tip: 100 microns</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>CKX31</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>AXOPATCH 200B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer Interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>INSTRUTECH Corporation</td>
<td>ITC-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>CV 203BU</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes

ويهدف البروتوكول المقدمة هنا لدراسة تفعيل تصرف كبير ، والجهد وكا 2 + تنشيط K + (BK) القنوات. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لدراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة أخرى لقنوات ايون ومستقبلات الناقل العصبي 1. وأعرب على نطاق واسع في أنسجة BK قنوات مختلفة ، وتورطت في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، بما في ذلك تنظيم تقلص العضلات الملساء ، وضبط التردد لخلايا الشعر والتنظيم الداخلي للإفراج العصبي 2-6. يتم تنشيط قنوات BK بواسطة الاستقطاب غشاء الخلايا ، والكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + 6-9. ولذلك ، تم تصميم بروتوكول للسيطرة على كل من الجهد والحل غشاء الخلايا. في هذا البروتوكول ، ويتم حقن الحمض النووي الريبي رسول قنوات BK في البويضات المورق القيطم (V - المرحلة السادسة) ، يليه 2-5 أيام من الحضانة عند 18 درجة مئوية 10-13. يتم رفعه بقع الغشاء الذي يحتوي على واحد أو عدة قنوات BK مع التكوين من الداخل إلى الخارج باستخدام تقنيات المشبك التصحيح 10-13. هو perfused الجانب الخلايا من التصحيح المطلوب مع حلول أثناء التسجيل بحيث يمكن فحص تفعيل قناة تحت ظروف مختلفة. لتلخيص ، يتم حقن مرنا من القنوات BK في البويضات المورق القيطم قناة للتعبير عن البروتينات على غشاء البويضة ، وتستخدم تقنيات المشبك التصحيح لتسجيل التيارات المتدفقة عبر قنوات تحت الجهد للرقابة والحلول داخل الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes at JoVE.com

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات BK<em&gt; البويضات القيطم</em&gt; عن طريق حقن رسول الحمض النووي الريبي. يتم التحكم في حل الخلايا خلال تسجيلات المشبك التصحيح من خلال نظام الارواء.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

20.8K Views.  Washington University in St. Louis. ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات BK البويضات القيطم عن طريق حقن رسول الحمض النووي الريبي. يتم التحكم في حل الخلايا خلال تسجيلات المشبك التصحيح من خلال نظام الارواء.

Video: Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...