המחברים מודים לגב &#39;ג&#39;ניפר מ Lommel וטרה נ Rognan לצורך תחזוקה של צמחי ארבידופסיס. עבודה זו נתמכה על ידי סטארט כספים אוניברסיטת סנט לואיס ו - National Institutes of Health מענקים 1R15GM086846-01 ו-01S1 3R15GM086846 אל שיאו וו.

I. גנטיות מעבר 1. מסרס ההורה הנקבי כדי להבחין בין אללים אימהי ואבהי באמצעות רצף ה-DNA פולימורפיזם, שני ecotypes שונים, כגון קולומביה-0 (Col-0) ו הימלר, ייבחרו כהורים הנשית והגברית. הצמחים צריכים להיות צעירים ובריאים. אפשר לסרס ההורה הנקבי באמצעות מיקרוסקופ לנתח, מגדלת מגן, או בעין בלתי מזוינת. אתר הבמה 12 פרחים (סמית. Et al 1990) והסר פרחים או siliques מעל ומתחת להם על ידי חיתוך הבסיס של pedicel עם המספריים. לעקר מלקחיים על ידי טבילה הבסיס של קצה בעדינות לתוך מבחנה של אתנול 95%, אשר תסיר את כל גרגרי אבקה על מלקחיים ולהרוג את האבקה גם כן. לחטט בעדינות לגזרים את ניצני פרחים באמצעות מלקחיים, להסיר בעדינות 4 עלי גביע, 4 עלי כותרת, ו -6 אבקנים, עוזב פיסטיל החשוף ללא פגע. נסו להימנע נזק carpels במהלך תהליך זה. 2. בחירת התורם אבקה וביצוע ההאבקה התורמים הטובים ביותר הם אבקה anthesed פרחים לפתוח בשלב 14 עם עלי הכותרת הארכת בזווית של 90 מעלות על פיסטיל (סמית. Et al 1990), שבו הרבה אבקה היא לשפוך. תפוס את פרח בבסיס בדיוק מעל pedicel, אשר תגרום לפרח להפיץ פתוח. אבק את הסטיגמה של פיסטיל הכינו עם מאבק. לאחר ההאבקה, הסטיגמה יהיה מכוסה אבקה צהובה, אשר ניתן לצפות בקלות תחת מיקרוסקופ. 3. סימון הצלב לאחר מאביקים כל עליים מסורס על צמח, ומתייגים את הצלב עם תג תכשיטים מידע להורים הנשית והגברית ותאריך. המקום יתד באדמה קרוב הצמח, להשתמש במחרוזת לקשור את גזע של תפרחת אל המוקד, ולכסות את עליים pollinated עם שקית פלסטיק. השנייה. בידוד של רקמות האנדוספרם של ארבידופסיס 1. הכנת חומרים בדרך כלל אנחנו מקבלים חומרים הדרושים מוכן לפני קצירת האנדוספרם ורקמות העובר: מיכל חנקן נוזלי, חנקן נוזלי, מיקרוסקופ לנתח, שני זוגות חדשים של עדין קצה מלקחיים (5 Inox FST ידי דומון ביולוגיה, שוויץ.) זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ( 3 &quot;X 1&quot; X 1.0 מ&quot;מ), 5.7 pH פתרון של M 0.3 ו - 5 מ&quot;מ סורביטול MES. 2. איסוף siliques ב - 7 או 8-יום לאחר ההאבקה-(DAP), זרעים מוכנים להיות שנקטפו על אמצע לטרפד לשלב מאוחר של העובר ואת גזור עבור האנדוספרם ואת העובר. לפעמים, זה עלול לקחת 9-10 DAP אם הפרחים מסורס צעירים מדי. 3. האנדוספרם בידוד העובר מאז זרעי ארבידופסיס זעירים, אנו משתמשים במיקרוסקופ לנתח לבודד האנדוספרם ואת העובר. שים silique 8-DAP תחת מיקרוסקופ, להשתמש זוג מלקחיים להחזיק את pedicel silique ולהשתמש קצה זוג נוסף של מלקחיים להחליק silique לפתוח את בשוליים שבו השניים מתמזגים carpels. השתמש זוג מלקחיים לאסוף זרע אחד על 5.7 פתרונות ה-pH של 0.3 M ו - 5 מ&quot;מ סורביטול MES, לעשות חתך קטן בסוף micropyle להחליק את העובר, לסחוט את הסוף חתוכים לדחוף את האנדוספרם ו האנדוספרם נפרד מן המעיל זרע (Kinoshita et al. 2004). שים את העובר לתוך האנדוספרם microtubes נפרד חנקן נוזלי. המשך עד שאנחנו צוברים העובר או האנדוספרם 10-15 siliques ולאחר מכן לאחסן את הצינורית למקפיא -80 מעלות צלזיוס. במקרים מסוימים, האנדוספרם לא צריך להפריד את המעיל זרע, כלומר, אפשר לבודד RNA הכולל האנדוספרם ואת מעיל תערובת זרעי לניתוח החתמה גן. ג. Bisulfite סידור 1. חובה ריאגנטים אמוניום ברומיד Cetyltrimethyl (CTAB) להכנת דנ&quot;א גנומי, אנזימי הגבלה, 3 M NaOH (טריים), 6.42 מ &#39;אוריאה / 4 bisulfite M נתרן (2 metabisulfite M נתרן, סיגמא אולדריץ, S9000, Na2S2O5, מולקולרית משקל: 190), הידרוקינון 10 מ&quot;מ, ערכת טיהור דנ&quot;א (DNA Promega אשף לנקות מערכת, חתול. # A7280), TE חיץ, 6.3 M NaOH (טריים), 10 מ NH 4 OAc, 20 מיקרוגרם / tRNA μL, אתנול ו - 100% . 2. פרטי פרוטוקול הטיפול bisulfite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנדוספרם או לבודד DNA גנומי העובר באמצעות הליך CTAB (רוג&#39;רס Bendich, 1988). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר 100 ננוגרם - 2 מיקרוגרם של ה-DNA הגנומי של μL 20-100 בנפח כולל μL עם אנזימי הגבלה, כי לחתוך מחוץ לאזור כדי להיות מנותח. עבור האמרגן MEA, אנו משתמשים XhoI, NdeI ו PstI או HindIII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל אנזימי הגבלה על ידי ה-DNA רותחים במשך חמש דקות ואז להרוות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 / 9 נפח (2.2 μL עבור DNA 20 מתעכל μL) של 3 M NaOH ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הפתרון צינור 250 PCR μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 7.5 גרם של אוריאה ב 10 מ&quot;ל של מים מזוקקים סטריליים; לאט להוסיף 7.6 גרם נתרן metabisulfite מעל 1-2 שעות חימום בדרך כלל עוזר המסת; התאם את ה-pH ל 5 עם טריים 10 M NaOH, הוסף מים מזוקקים סטריליים על סופי נפח מ&quot;ל 20. זוהי 6.24 אוריאה ז / 4 bisulfite M פתרון נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.24 אוריאה ז / 4 bisulfite M נתרן פתרון ריכוז סופי של 5.36 מ &#39;ו 3.44 מ&#39;, בהתאמה (Paulin et al., 1998). לדוגמה, להוסיף 208 μL של אוריאה 6.42 M / M 4 bisulfite נתרן פתרון μL 22.2 לעיל של הדנ&quot;א הגנומי מפוגל (שיאו et al., 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הידרוקינון 10 mM ל-DNA בריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ (12 μL לעיכול 20 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות טיפול bisulfite במכונה PCR: 30 מחזורים של 55 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ו 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt את ה-DNA bisulfite שטופלו באמצעות מערכת לנקות אשף דנ&quot;א Promega ומעקב פרוטוקול (ג&#39;ייקובסן et al., 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את נפח המדויק של TE התאושש הטור לאחר desalting ולהוסיף 6.3 M NaOH ריכוז סופי של 0.3 מ &#39;לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 M NH 4 OAc (pH 7.0) לריכוז סופי של M 3, 2 μL של 20 מיקרוגרם / tRNA μL, 3 כרכים של 100% אתנול ואז לערבב. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 14,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור פעם אחת עם 70% אתנול, לעשות צנטריפוגה קצר, ולהסיר אתנול נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש גלולה ב speedvac למשך 5-10 דקות ו resuspend ב 25-100 μL חיץ TE בהתאם החל כמות ה-DNA. נתרן bisulfite שטופלו DNA עכשיו הוא מוכן לניתוח PCR. </li></ol> 3. PCR הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז cytosines unmethylated מומרים אורציל, קשה כדי להגביר ושבר גדול באמצעות DNA bisulfite שטופלו כתבנית. לפיכך, אנו בדרך כלל עיצוב primers להגביר מוצר לא יותר מ 500 נ&quot;ב. רצף האמרגן 4-kb MEA, עיצבנו קבוצות רבות של primers ואת מוגבר 14 שברים חופפים כדי לכסות את האזור כולו (שיאו et al., 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי רצף העליונה גדיל, בעיצוב פריימר קדימה, אני) לבחור (G גואנין) עשיר באזור על מנת להיות חישול בטמפרטורה גבוהה ללא נוקלאוטידים ארוך במיוחד של primers; II) לשנות C (ציטוזין) ל-Y ( פירימידין) בשעה CG והקשרים CNG ולשנות את C הנותרים T (תימין). בעיצוב פריימר הפוכה, אני) בוחר אזור C עשיר; II) לשנות את G R (purine) בשעה CG והקשרים CNG ולשנות את G הנותרים A (אדנין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף התחתונה גדיל, בעיצוב פריימר קדימה, אני) בוחר אזור C עשיר; II) לשנות את G R ב CG והקשרים CNG ולשנות את G הנותרים א בעיצוב פריימר הפוכה, אני) לבחור אזור ה-G-עשיר; II) לשנות את C ל-Y (פירימידין) בשעה CG והקשרים CNG ולשנות את C הנותרים ט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בדרך כלל להשתמש 1-2 μL של ה-DNA נתרן bisulfite שטופלו כתבנית הגברה כל PCR (שיאו et al., 2003). מוצר ה-PCR צריך להיות מנותח על ידי אלקטרופורזה בג&#39;ל על מנת לאשר את הגודל הנכון של שבר, ולאחר מכן להיות מטוהרים ג&#39;ל משובטים לתוך ת&quot;א Topo שיבוט וקטור pCR2.1 (Invitrogen) כמו להוסיף. מושבת יחיד הרים ותרבותיים; DNA פלסמיד חילוץ ושלח עבור סידור. </li></ol> 4. רצף ניתוח העיקרון של רצף bisulfite היא ציטוסין unmethylated יומרו אורציל בשל deamination hydrolytic על ידי ריכוז גבוה של bisulfite נתרן ב pH5.0 אשר יהיה מוגבר כמו תימין במוצר ה-PCR, בעוד 5-מתיל ציטוזין לא יהיה שונה על ידי bisulfite נתרן ולהישאר להיות ציטוזין לאחר הגברה PCR (Clark et al, 1994;. פרומר et al, 1992).. לאחר השגת התוצאה ריצוף, נשווה את זה עם תבנית גדיל ספציפי המשמש הגברה PCR. אם שאריות ציטוסין בתבנית קורא כמו תימין בתוצאה רצף, מעידה על כך ציטוסין אינו מפוגל. אם שאריות ציטוסין בתבנית נשאר ציטוסין ב רצף, זה אומר כי ציטוסין הוא מפוגל. IV. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="איור 1 /" /> באיור 1.

<ol>
	<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning.">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation.">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li><li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants.">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li><li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm.">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li><li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis.">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li><li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation.">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li><li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis.">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li><li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5'-+methylcytosine+in+genomic+DNA.">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li><li>Rogers, S. O., &amp;amp, B. e. n. d. i. c. h., J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+plant+tissues.">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Flower+Development+in+Arab&#237;dopsis.">Early Flower Development in Arab&#237;dopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase.">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

קל יחסית להפריד העובר מן האנדוספרם ואת המעיל זרע, אבל זה משעמם להפריד האנדוספרם מן המעיל זרע, במיוחד עבור זרע בשלב מוקדם או אמצע לטרפד של העובר. מאז מעיל הזרע רק תורם כמות קטנה מאוד של רקמה, עבור גנים מסוימים, למשל, MEA ו FWA, אין לנו להפריד את האנדוספרם מן המעיל ז?...

ספקי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצה מלקחיים פיין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשיטים תגית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמח תחרות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחרוזת או טוויסט-Ties </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;שקיות פוליאתילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 &quot;X 1&quot; X מיקרוסקופ שקופיות 1.0 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכלי חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים חסום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנורות ה-PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermocycler </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל אלקטרופורזה מתקן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבידופסיס thaliana קולומביה-0 צמחים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבידופסיס thaliana לנדסברג erecta צמחים </li></ul> ריאגנטים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 מ סורביטול ו 5 מ&quot;מ MES-pH 5.7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמוניום ברומיד Cetyltrimethyl (CTAB) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cholorform </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת אנזימים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 M NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.3 M NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.24 מ &#39;דשן / 4 bisulfite M נתרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי מזוקקים H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM הידרוקינון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשף ה-DNA לנקות מערכת (Promega) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ NH 4 OAc </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מיקרוגרם / tRNA μL </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד ת&quot;א Topo שיבוט Kit (Invitrogen) </li></ul>

determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm

Thaliana ארבידופסיס הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מנגנוני epigenetic. אחת הסיבות היא מוטציה הפסד-of-null פונקציה של methyltransferases DNA היא בת קיימא, ובכך לספק מערכת ללמוד איך הפסד של מתילציה DNA בגנום משפיע על הגדילה וההתפתחות. החתמה מתייחס הביטוי ההפרש של אללים אימהי ואבהי ובעל תפקיד חשוב בהתפתחות רבייה הן יונקים וצמחים. מתילציה DNA הוא קריטי לקביעת אם אללים אימהי או אבהי של הגן המוטבע מבוטא או מושתק. בשנת צמחים פורחים, יש אירוע הפריה כפולה רפרודוקציה: תא הזרע מפרה את הביצית ליצירת העובר ואת הנתיכים הזרע השני עם תא מרכזי להצמיח האנדוספרם. האנדוספרם היא הרקמה בה החתמה מתרחשת בצמחים. MEDEA, תחום SET גן Polycomb הקבוצה, FWA, גורם שעתוק ויסות פריחה, הם הראשונים שני גנים הראו להיות טבועה האנדוספרם והביטוי שלהם נשלטת על ידי מתילציה של דנ&quot;א demethylation צמחים. על מנת לקבוע את מעמדם החתמה של גן דפוס המתילציה של האנדוספרם, אנחנו צריכים להיות מסוגלים לבודד את האנדוספרם הראשון. מאז הוא זרע זעיר ארבידופסיס, הוא נותר מאתגר לבודד את האנדוספרם ארבידופסיס ולבחון מתילציה שלה. בפרוטוקול זה וידאו, אנו מדווחים איך לנהל את צלב גנטית, לבודד רקמת האנדוספרם מזרעים, כדי לקבוע את מצב המתילציה על ידי רצף bisulfite.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm at JoVE.com

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים מוטבעים<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; יכול להיות קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד את האנדוספרם ולקבוע מתילציה של רצפי bisulfite.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

17.4K Views.  Saint Louis University. החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים מוטבעים ארבידופסיס יכול להיות קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד את האנדוספרם ולקבוע מתילציה של רצפי bisulfite.

Video: Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...