Bisulphite המרה פרוטוקול פרוטוקול סטנדרטי עבור ההמרה של 2 מיקרוגרם של הדנ&quot;א הגנומי מתואר להלן. כמויות קטנות יותר או גדולות יותר של הדנ&quot;א הגנומי (100 PG-200 מיקרוגרם) יכול להיות גם bisulphite מטופלים בהצלחה. אלה התנאים התגובה התוצאה המרה מלאה (99.5-99.7%) של כמעט כל רצף ה-DNA היעד 3. 1. ה-DNA הכנה הכינו דגימות הדנ&quot;א הגנומי ידי דוגרים עם הצפת תמוגה bisulphite דנ&quot;א (2 מיקרוגרם t-RNA, 280 ng / μl proteinase K, 1% SDS) בהיקף כולל של 18 μl עבור שעות 1 ב 37 ° C. הערה: זה חשוב כדי להשיג bisulphite המרה מירבית, במיוחד עם ה-DNA שבודד דגימות קליניות שם עדיין עשויה להיות קשורה חלבון ה-DNA. 2. ה-DNA denaturation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל 2 מיקרוגרם DNA בנפח של 20 μl על ידי הוספת 2 μl של המוכן טרי 3M NaOH ל ג הגמרoncentration של 0.3M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבט מים, ואחריו הדגירה על 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות בתוך גוש חום. מיד למקום צינורות על קרח דק &#39;5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 4 מעלות של 10 גרם ב 10,000, כדי להבטיח את ה-DNA הוא בתחתית של התחתית. </li></ol> 3. Bisulphite Deamination Sulphonation &amp; Deamination hydrolytic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות טריים של 10 Quinol רווי mM נתרן metabisulphite pH 5.0 (7.6 גרם Na 2 S 2 O 5 עם 464 μl של 10 M NaOH, עשה עד 15 מ&quot;ל מים). הפתרון של bisulphite נתרן רווי מושגת על ידי היפוך בעדינות את תערובת מגיב / H 2 O, עם ערבוב מינימלי אוורור. במידת הצורך, להתאים את ה-pH עם 10 M NaOH, עבור פירוק מלא של metabisulphite הערה:. כפי שהוא פתרון רווי, גושים קטנים עדיין יכולים להישאר שלא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 208μl של metabisulphite רווי 12 μl של Quinol 10mm ל-DNA מפוגל (20 μl), נפח סופי של 240 μl לריכוז סופי של 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0. בעדינות מערבבים את כל ריאגנטים צנטריפוגות במשך 10 שניות בלבד כדי להבטיח את כל הטיפות נמצאים בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי דגימות עם 200 μl של שמן מינרלי. דגירה דגימות ב 55 מעלות צלזיוס באמבט מים, במשך 4-16 שעות. אורך הטיפול bisulphite תלוי בכמות ובאיכות של ה-DNA להיות מומר. עבור ה-DNA באיכות ירודה או דנ&quot;א מושפל, להגביל את זמן הדגירה עד 4 שעות. הערה: חשוב כי ההמרה bisulphite מתקיים בחושך, כדי למנוע חמצון, כך שאם זה לא ניתן לעטוף את הצינורות בנייר כסף לפני הדגירה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום זמן הדגירה מתאים, לסובב את הצינורות בקצרה microcentrifuge כדי להבטיח את כל הנוזל בתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר את ה-DNA טיפול bisulphiteמתחת לשכבת הנפט על ידי בקפידה pipetting את פתרון ה-DNA מהחלק התחתון של הצינור, בלי לקחת את כל שמן מינרלי. </li></ol> Desalting <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל היונים bisulphite חינם על ידי עובר דרך עמודה desalting ו משחררי ב μl של 50 מילי-Q מים (MQH 2 O). תלוי בכמות ובאיכות של הדנ&quot;א הגנומי ואיך הוא מוכן, טורים desalting שונים יכולים לשמש. אנו משתמשים באופן שגרתי Promega אשף ניקוי עמודות, כמו עמודות אלה מתאימים להסיר SDS המשמש בהכנת ה-DNA לפני ההמרה. </li></ol> אלקליות Desulphonation <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Adduct bisulphite יוסר הטבעת אורציל ידי desulphonation. Desulphonate ידי הוספת 5.5 μl של המוכן טרי 3M NaOH ריכוז סופי של 0.3M, אז דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה ולהוסיף 1 μl של t-RNA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li> &lt;li&gt; מנטרלים את הפתרון על ידי תוספת של 33 μl של אמוניום אצטט (NH 4 O Ac), pH 7.0 עד ריכוז סופי של 3M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול, להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת 330 μl של אתנול קרים 100%, ומערבבים היטב על ידי היפוך. השאר ב-20μC עבור שעות 1 עד לילה. צנטריפוגה ב g 14,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C. הסר את כל עקבות של supernatant ואוויר יבש זירז את ה-DNA של ~ 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את גלולה דנ&quot;א μl 50 / מיקרוגרם של 0.1 TE (10mm טריס-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) או H 2 O. השאירו בטמפרטורת החדר למשך כ 2hrs. מערבולת מדי פעם הצינורות כדי להבטיח את ה-DNA הוא מומס, ואחריו צנטריפוגה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיד הגברה PCR, או לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1-10 שנים, תלוי בכמות ואיכות ה-DNA. </li></ol> 4. PCR הגברה פריימר עיצוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנון יעיל של ה-PCR bisulphite המרה ספציפי primers הוא cruciaאני להבטיח כי הגברה יעיל, מוטה לחלוטין של ה-DNA המרה מתרחשת. הקווים המנחים הבאים משמשים כדי לסייע בעיצוב פריימר. </li></ol> עיצוב פריימר הנחיות <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק הגברה PCR היחסי של ה-DNA ואת מפוגל unmethylated, השתמש 50:50 מפוגל / Unmethylated bisulphite מלא מדגם לשלוט המרה ולהגביר עם bisulphite ספציפי המרה primers בתנאים אופטימיזציה תגובת PCR (איור 3). עבור מפוגל 50:50: שליטה Unmethylated, להשתמש ב-DNA במבחנה SssI מפוגל ואו הגנום כולו מוגבר (WGA) דנ&quot;א או דנ&quot;א דם כולו. שים לב כמה גנים יהיו מפוגל באופן טבעי בדם, ולכן במקרים אלה עדיף להשתמש רק WGA ה-DNA כמו שליטה &quot;Unmethylated&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות תגובת PCR הגברה ב 100 &amp; mu; aliquots אני המכיל 2 μl של ה-DNA הגנומי bisulphite המרה, 200 מיקרומטר dNTP 1, primers מיקרומטר, 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10mm טריס-HCL, pH 8.3 ו 0.15 פולימראז תקי μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב thermocycler שיפוע טמפרטורה, קבע את התגובה לרוץ צבע + / - 3 מעלות צלזיוס מן אני החזוי של פריימר על פני 10 צינורות </li></ol><img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק כי amplicons מפוגל ו unmethylated כבר מוגבר בפרופורציות, amplicon יכולים להתעכל עם אנזים הגבלה אינפורמטיבי, כגון תקי 1 (TCGA), כי יהיה לעכל דנ&quot;א מפוגל אך לא לעכל דנ&quot;א unmethylated כאשר האתר הוא אנזים הגבלה שינה לאחר ההמרה bisulphite כדי TTGA. היקף העיכול ניתן דמיינו ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose (איור 3A). לחלופין, SYBRGreen (0.2 μl של דילול 1:1000) ניתן להוסיף את תגובת ה-PCR והיקף מתילציה ניתן להעריך על ידי ביצוע חום מגרשים דיסוציאציה בזמן אמת PCR thermocycler (איור 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב PCR תגובת כולל MgCl 2 תנאים ריכוז thermocycling ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי להגביר את יעילות ה-PCR או כדי להבטיח הגברה PCR היחסי של שברי PCR מפוגל ו unmethylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע התנאים PCR מותאמים, הגברה PCR יכול להתבצע על דגימות המרה bisulphite. הערה: לאחר אני מותאם טמפרטורה הדרגתי PCR לא צריך להיות בשימוש. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמה אופטימיזציה הגברה PCR bisulphite מוצגת באיור 3. תנאים אופטימליים PCR הגברה צריך להגביר amplicons מפוגל ו unmethylated בפרופורציה וללא משוא פנים. איור 3A מציגה ג&#39;ל agarose עם פרופיל שיפוע הטמפרטורה הגברה PCR מתערובת של DNA ו - 50% מפוגל unmethylated. ה &#39;דואר amplicons PCR טופלו אנזים הגבלה, תקי 1 (TCGA), כי יהיה לעכל מפוגל (M) DNA אך לא לעכל unmethylated (U) הדנ&quot;א באתר אנזים ההגבלה משתנה על ידי המרה bisulphite כדי TTGA. כמות שווה של לחתוך נימול מוצר PCR צפוי אם ה-DNA ואת מפוגל unmethylated מוגבר בפרופורציה. ניתן לראות על ג&#39;ל זה שהתנאים thermocyling הגברה אופטימלית ללא משוא פנים נמצאת 56.1 ° C (T). המרה מלאה של ה-DNA bisulphite יכול גם להיות מנותח על ידי אנזים העיכול עם ציטוזין לאתר ספציפי כגון HPA III (CCGG). HPA III רק לעכל אם ההמרה נכשלה, כמו באתר הגבלה יישמר. אם השלמת ההמרה באתר הגבלה יומרו TCGG או TTGG בהתאם למצב המתילציה של הדנ&quot;א. ה-DNA השלם המרה bisulphite ניתן לראות באיור 3 א (ג). איור 3 ב מציג עלילה אמיתית דיסוציאציה זמןיכול לשמש גם ככלי כדי לקבוע אם יש הטיה הגברה המבוססת על בטמפרטורה שבה מולקולות שונות יהיה לנתק. בתרשים זה ניתן לראות כי ה-PCR יש מוגבר מפוגל (M) ו unmethylated (U) DNA ביחס מתערובת של DNA ו - 50% מפוגל unmethylated לעומת הגברה הבקרה של ה-DNA מפוגל מלא unmethylated אשר לנתק את 82.1μC ו 78.9μC בהתאמה. אחרי אופטימיזציה של thermocyling ותנאי התגובה Bisulphite דגימות טיפול יכול להיות מוגבר עם פריימרים ספציפיים גדיל bisulphite ספציפית או תגובה אחת או חצי PCR מקוננות. שברי כתוצאה PCR ניתן דמיינו ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ואת רצף במישרין (איור 4 א) או על ידי שיבוט וסדר. לאחר שיבוט רצף המדינה מתילציה של מולקולות בודדות ניתן tabulated, במפה bisulphite (איור 4B), כדי להמחיש את ההטרוגניות שלמתילציה. תפוקה גבוהה כמותי וניתוח מתילציה ניתן preformed שימוש בטכנולוגיה כגון זה מנוצל על ידי שיטת EpiTYPER Sequenom. באמצעות שיטה זו, ה-DNA המרה bisulphite מוגבר עם bisulphite ספציפי PCR primers ואחריו תהליך מחשוף proprietry. שברים כתוצאה מכך הם ונרשמת ידי ספקטרומטריית MALDI-TOF המוני עם ספקטרום ספציפי תלויה בנוכחות cytosines מפוגל (איור 5A). סיכום יחסי מתילציה במדגם לאחר מכן ניתן להסיק בצורת מכתם (איור 5 ב) או עלילה מתילציה (איור 5 ג). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטית CPG מפוגל. בתא נורמלי, האמרגן-CPG הקשורים האיים הם בעיקר unmethylated (אפור) ואילו אתרי CPG בתוך גופים הגן הם בדרך כלל דליל מפוגל (אדום). הפאנל בצד ימין מרחיבה את struct מולקולריתיור של ה-DNA באתר CPG הפרט מראה מתילציה עם מולקולה CH3 על פחמן 5 של ציטוזין. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> באיור 2. . כימית סכמטית המרה ניתוח של מתילציה בדנ&quot;א כולל ארבעה שלבים עיקריים כפי שמוצג; denaturation, המרה bisulphite, הגברה PCR וניתוח. בחלונית הימנית, שינויים המולקולה ציטוסין המתרחשים במהלך ההמרה bisulphite מתוארים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> באיור 3. אופטימיזציה של ה-PCR הגברה א. Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה עם פרופיל שיפוע הטמפרטורה הגברה PCR מתערובת של DNA ו - 50% מפוגל unmethylated. רסיסים כבר מעוכל עם או Taq1 (T) או HpaIII (H) אשר לעכל דנ&quot;א מפוגל ולא DNA המרה bisulphite בהתאמה. ב חום ניתוח עקומת דיסוציאציה מראה equaשיעור l של ה-DNA ואת מפוגל unmethylated (אדום לערבב קו 50/50) לעומת הגברה השליטה מפוגל מלא (קו ורוד, M) ו-DNA unmethylated (קו ירוק, U) אשר לנתק ב 82.1 ° C ו 78.9 ° C בהתאמה. <img alt="איור 4 א" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="תרשים 4 ב" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> איור 4. דוגמה של רצף ישיר מפה bisulphite א. רצף עקבות של שלוש שורות תאים שונים עם אתרים CPG מודגשות בצהוב. Cell קו X מציג מתילציה 100% בכל שלושת אתרי CPG בעוד שורות תאים Y ו-Z להראות בדרגות שונות של מתילציה כפי שנראה על ידי חופפים G / אותות. ב נציג bisulphite מפה המציגה את צפיפות מתילציה (נקודות אדומות) באתרים CPG בודדים, כפי שנקבע על ידי רצף ישיר של שיבוטים בודדים. <img alt="איור 5 א" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> איור 5. תפוקה גבוהה באמצעות ניתוח דנ&quot;א מתילציה Sequenom א. ספקטרום להציג באמצעות טכנולוגיה Sequenom epiTYPER. שברי DNA להציג ספקטרום ספציפי, בהתאם לכמות של ההווה מתילציה בדנ&quot;א. ב מכתם סיכום של אחוז מתילציה DNA בכל אתר CPG ארבע שורות תאים שונות. העלילה C. סיכום מתילציה נגזר מכתם Sequenom.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מתילציה DNA על ידי ניתוח רצפי הדנ&quot;א הגנומי של המרה bisulphite היא שיטה מבוססת היטב צדדי המאפשר זיהוי וכימות של מתילציה בדנ&quot;א ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד. עם זאת, ההמרה bisulphite וניתוח לאחר מכן מסתמכת על ההנחה כי ה-DNA שהומרה באופן מלא עם כל ציטוסין unmethylated להיות deaminated כדי אורציל ורק cytosines מפוגל שנותרו בלתי תגובתי. אם הגיור אינו שלם, עלולות להתעורר בעיות עם ניתוח מאז cytosines unmethylated unconverted עשוי להתפרש באופן שגוי כמו cytosines מפוגל. המרה Bisulphite יכול להיות מותאם בשלבים שונים כדי למקסם את אחוז ההמרה. עבור ה-DNA כדי שניתן יהיה להמיר אותו במלואו הראשון חייב להיות חד גדילי כך שאריות ציטוסין נחשפים יוני bisulphite. הצעד הראשון, denaturation DNA, הוא קריטי ויכול להיות מקור המרה שלם אם ה-DNA אינו מפוגל לחלוטין. על מנת להבטיחכי ה-DNA הוא מפוגל מלא חשוב הפרמטרים כולל הסרת תגובה של חלבון בכל הקשור, ריכוז מלח מתאימים, טמפרטורת הדגירה ובזמן המתאימים כדי לשמור על ה-DNA קונפורמציה תקועים אחד. חשוב להשתמש טרי NaOH 3M ולאפשר זמן הדגירה מספקת. אם ה-DNA הוא מתנגד denaturation, כמה שינויים בפרוטוקול כולל הארכת זמן הדגירה עד 30 דקות או פיצול ה-DNA לפני denaturation עשוי להקל denaturation DNA. בנוסף, ה-DNA גדילי יחיד (ssDNA) עשוי לחשל מחדש להכפיל את ה-DNA גדילי (dsDNA) במהלך התגובה bisulphite המרה. ביצוע התגובה בטמפרטורה גבוהה יותר (90-95 מעלות צלזיוס) או מעת לעת, או באופן רציף במהלך התגובה bisulphite יכול לסייע בשמירה על ssDNA. עם זאת, חשוב להיות מודעים לכך השפלה DNA הוא מואץ מאוד על אלה טמפרטורות גבוהות יותר. ריאגנטים שונים ניתן גם להוסיף לשבש מחדש חישול של הדואר גדילי דנ&quot;א, כגון אוריאה. ריכוז ה-DNA ואיכותו יכול להשפיע גם על היעילות של התגובה bisulphite ו האולטימטיבי תשואה PCR. השפלה DNA הוא מגבלה של פרוטוקול המרה bisulphite. הטיפול הכימי של הדנ&quot;א מציגה הפסקות גדיל שונים ssDNA וחלק התנאים הקשים הדרושים המרה bisulphite מלא כולל ריכוז bisulphite גבוהה, פעמים דגירה ארוך יכול להאיץ השפלה DNA. בתנאים סטנדרטיים תגובה תיאר, השפלה DNA הוא לא בעיה נפוצה עם זאת, אם השינויים הם הציגו פרוטוקול, כגון רצפים שאינם עקשן המרה, עבור תבניות דנ&quot;א מפורקים או באיכות ירודה, כגון דגימות FFPE, אז השפלה DNA יכול להיות מגבלה משמעותית. פורמלין פרפין קבוע, מוטבעים (FFPE) דגימות DNA מושפל יכול להיות יעיל bisulphite המרה מוגבר בפרוטוקול זהאך שינויים על מנת להבטיח כי ה-DNA אינו מושפל עוד יותר מומלץ. השימוש של RNA מוביל כגון t-RNA מומלץ. כמו כן הגליקוגן ניתן להוסיף כנשא כאשר ריכוז ה-DNA הוא נמוך (&lt;200 ננוגרם). בגלל ה-DNA שבודד רקמות FFPE כבר מקוטעת פיצול נוסף מתקיים במהלך deamination, יש להקפיד למזער השפלה נוספת. אל ה-DNA שבר נוספת לפני denaturation ולהגביל את זמן הדגירה של התגובה bisulphite עד 4 שעות. עיצוב amplicons לא יותר מאשר 300 נ&quot;ב עקב DNA מקוטעת. גורם נוסף שיכול להשפיע על הגברה PCR כי ההמרה bisulphite של cytosines unmethylated מפחית את המורכבות של תבנית ה-DNA. פריימר הבאים עיצוב פרוטוקול המפורטים בסעיף 4.1, אורך פריימר מוגברת PCR מקוננים יכולים לעזור להגביר את הספציפיות ואת התשואה PCR. לבסוף, מאז תבנית ה-DNA משתנה במהלך bisulphITE המרה, הטיה הגברה יכולה להיות דאגה. ודא הגברה יחסי PCR של תבניות מפוגל ו unmethylated מסומנת עם תערובת 50/50 לשלוט DNA M / U, כפי שמתואר בפרוטוקול, ראה איור 3. כמו כן, להבטיח כי הגברה של תבניות המרה רק מתרחש באמצעות אנזים HpaIII הגבלה ג&#39;ל אלקטרופורזה (איור 3). התנאים PCR עשויה צריך להיות מותאם על ידי שינוי ריכוז הטמפרטורה ו / או מגנזיום או הארכת זמן הארכה. מספר תבניות להיראות בעייתי במיוחד ואת המיקום פריימר ייתכן שיהיה צורך להתאים או מנוונת primers ייתכן שיהיה צורך בשימוש. הדור הבא רצף טכניקות הם המתפתחת במהירות כדי להשיג החלטה דומה bisulphite רצף גנומי, ו דור שלישי יחיד רצף מולקולה יש את הפוטנציאל כדי לאפשר ניתוח של ה-DNA הן מתילציה יסודי ללא צורך רצף bisulphite. עם זאת, זמינות spec נרחבתificity של טכניקות אלה נשארים זמן משם. רצף הגנומי Bisulphite הוא תקן הזהב בניתוח מתילציה הוא פרוטוקול חזקים. השיטה התקדמה עד לנקודה שבה הבעיות הנפוצות ואת המגבלות נפתרו ויישומים הרחיבו מ מנתח גן הפרט תפוקה גבוהה ניתוח הגנום כולו מתואר על ידי Clark et al. 2006 4. הנחיות והמלצות לפתרון בעיות נוספות המפורטות בטבלה 1. הוא הציע כי הגישה האופטימלית היא תחילה לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי ורק להציג את השינוי אם וכאשר מתעוררת בעיה. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="טבלה 2" /> טבלה 1. הנחיות לפתרון בעיות

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן Metabisulphite (אייאקס Finechem) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידרוקינון (Merck) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשף ה-DNA לנקות המערכת (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

אפיגנטיקה מתאר את תורשתי שינויים בתפקוד הגן המתרחשות באופן עצמאי רצף ה-DNA. הבסיס המולקולרי של ויסות הגנים epigenetic היא מורכבת, אבל בעצם כרוך שינויים DNA עצמו או את החלבונים עם ה-DNA אשר מקורביו. שינוי epigenetic העיקרי של ה-DNA בגנום של יונקים הוא מתילציה של נוקלאוטידים ציטוזין (5-MEC). מתילציה DNA מספקת הוראה מכונות ביטוי גנים כמו אל איפה ומתי הגן צריך לבוא לידי ביטוי. רצף היעד העיקרי מתילציה בדנ&quot;א של יונקים היא 5&#39;-CPG-3 &quot;dinucleotides (איור 1). Dinucleotides CPG אינם מפוזרים באופן אחיד לאורך הגנום, אבל מרוכזים באזורים של רצפי הגנום חוזרות CPG &quot;איים&quot; נפוץ הקשורים מקדמי גן (איור 1). ומתילציות DNA מבוססים מוקדם בהתפתחות, מווסתת במהלך התמיינות רקמות ספציפיות שיבשו במדינות רבות, כולל מחלת הסרטן. כדי understand את התפקיד הביולוגי של מתילציה דנ&quot;א ותפקידה מחלות אנושיות, מדויק, יעיל שיטות לשחזור נדרשים לזהות ולכמת בודדים 5-MeCs. זה פרוטוקול המרה bisulphite הוא &quot;תקן הזהב&quot; לניתוח מתילציה בדנ&quot;א ומקל על זיהוי וכימות של מתילציה בדנ&quot;א ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד. הכימיה של deamination ציטוסין ידי bisulphite נתרן כרוכה בשלושה שלבים (איור 2). (1) Sulphonation: תוספת של 5-6 bisulphite לקשר הכפול של Deamination (2) ציטוזין hydrolic: deamination hydrolytic נגזרת של ציטוזין-bisulphite וכתוצאה מכך לתת נגזרת אורציל-bisulphite (3) Desulphonation אלקליות: הסרת sulphonate קבוצה ידי טיפול אלקלי, לתת אורציל. Bisulphite מעדיפים deaminates ציטוסין כדי אורציל ב DNA גדילי יחיד, ואילו 5-MEC, הוא עקשן deamination bisulphite בתיווך. עם הגברה PCR, אורציל מוגברכמו תימין תוך 5-MEC שאריות להישאר cytosines, המאפשר CpGs מפוגל להיות נבדל CpGs unmethylated על ידי נוכחות של &quot;C&quot; מול ציטוזין ותימין שאריות &quot;T&quot; במהלך רצף. שינוי ה-DNA על ידי המרה bisulphite הוא פרוטוקול מבוססת היטב כי ניתן לנצל שיטות רבות של ניתוח מתילציה בדנ&quot;א. מאז הגילוי של 5-MEC על ידי המרה bisulphite הודגם לראשונה על ידי פרומר ואח&#39;. 1 וקלארק et al. 2, שיטות מבוססות סביב המרה bisulphite חשבון הדנ&quot;א הגנומי עבור רוב הנתונים החדשים על מתילציה בדנ&quot;א. שיטות שונות של ניתוח PCR פוסט עשוי להיות מנוצל, תלוי במידת הספציפיות ברזולוציה של מתילציה הנדרש. שיבוט וסדר היא עדיין השיטה הכי זמינים שיכול לתת פתרון נוקלאוטיד יחיד עבור מתילציה על פני מולקולת הדנ&quot;א.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ&quot;א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ&quot;א הגנומי היעד.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

dna-methylation-bisulphite-modification-and-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

104.3K Views.  Garvan Institute of Medical Research. תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ"א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ"א הגנומי היעד.

Video: DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS ייצור המכשיר ושינוי פני השטח

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

הפגנות חומרת הסביבה מופחתת כובד של טכנולוגיה cytometer זרימה וCompanion Microfluidic אב טיפוס מוקטנת ערבוב

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video