מחקר זה נתמך על ידי פרס הצטיינות ממשרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא, וNIH להעניק R01CA138528 לRW.

.1 הכנת בונת ביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל את הפרוטוקול, PRMTs שיבוט לתוך וקטורי ביטוי יונקים עם תג N-מסוף epitope (Myc או HA), ואת המצע במסגרת עם גלוטתיון-S-transferase (GST) לביטוי ברמה הגבוהה של חלבון וטיהור מתא חיידק lysates, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות מולקולריות סטנדרטית. </li></ol> .2 טיהור PRMTs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 100 תרבות מנות מ&quot;מ כדי לשמור על תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (Beas2B). מעבר התאים כל 3 ימים ולא נותן להם לגדול למפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני transfection, זרע 7.5 x 10 5 תאים במדיום תרבות 10 מ&quot;ל בצלחת תרבות 100 מ&quot;מ. מערבולת כדי לפזר באופן שווה את התאים, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב את התקשורת ולהוסיף 5 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות ללא סרום ואנטיביוטיקה. מערבולת ולשאוב את המדיום. חזור על פעולה זו אחתיותר זמן, ולבסוף מוסיף 5 מ&quot;ל של סרום / בינוני אנטיביוטיקה ללא ולהמשיך transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 מיקרוגרם של פלסמיד דנ&quot;א לתוך 750 μl של מדיום סרום ללא בצינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ&quot;ל, לדלל 30 μl של מגיב transfection ל750 μl של מדיום חופשי בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון בדילול מלא מגיב transfection (שלב 2.5) לצינור המכיל DNA בדילול מלא (שלב 2.4). מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת transfection בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, פיפטה תערובת transfection בעדינות על גבי התאים, מערבולת לערבב באופן שווה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 שעות, לשאוב את המדיום המכיל תערובות transfection מהתאים. הוסף בינוני תרבית תאים טריות בתוספת סרום ואנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidifiedחממה ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעה, lyse התאים ב 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה (שנאגרו מלוח 1x פוספט, 1% P-40, 0.5% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet, ו1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​phenlymethyl sulphonyl פלואוריד). לאסוף lysates לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק עם מרים תא דגירה lysates על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates ב15,000 XG 10 דקות בצנטריפוגה ספסל העליונה כדי לנקות את lysates מפסולת תא. [* מומלץ מאוד כדי לאשר את הביטוי של HA-PRMT1 באמצעות immunoblotting של aliquot של lysates עם אנטי HA נוגדנים, לפני שתמשיך לטיהור של האנזימים עבור assay מתילציה.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור של PRMTs, דגירה 3 מ&quot;ג של lysates תא עם 30 μl של 50:50 השעיה של אנטי HA מטריצת זיקה שבנאגרה מלוח פוספט (PBS), ולסובב את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במסובבי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לסובב את הצינורות ב 14,000 XG בצנטריפוגה ספסל העליון למשך 2 דקות כדי לאסוףחרוזים. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 3x עם 1 מ&quot;ל של Ripa חיץ [20 מ&quot;מ טריס (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 מ&quot;מ EDTA ו1% Triton-X-100] בכל שטיפה אחריו צנטריפוגה ב 14,000 XG עבור 2 דקות. לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את החרוזים פעם אחת עם של חיץ מתילציה 100 μl (50 מ&quot;מ טריס pH 8.5, 20 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 100 סוכרוז מ&quot;מ). לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant. חרוזים המכילים את PRMTs המשותק מוכנים לשימוש assay מתילציה. [* מומלץ מאוד להשתמש PRMTs המשותק באופן מיידי בassay מתילציה.] </li></ol> .3 טיהור של מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של GST-G3BP1 הפכה BL21 לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום לוריא-Bertani (LB) מכיל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין. לגדול תרבויות לילה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר את תרבות הלילה ל50 מ&quot;ל של מדיום LB טרי והמשךinue לגדול ל OD 600 של 0.5-0.7 (זה לוקח בערך 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר OD 600 מגיע 0.5-0.7, להוסיף איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ ולהמשיך לתרבות ל4 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,500 XG עבור 10 דקות, ולעבד את גלולה לטיהור GST או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות Re גלולה חיידקים ב5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה (1x PBS עם מעכבי פרוטאז, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של ליזוזים, ו0.1% Triton-X-100) ו דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בשלב זה lysates יופיע עכור וצמיג עקב השחרור של הדנ&quot;א הגנומי חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירה הדנ&quot;א הגנומי ידי sonication (10 פעימות של 1 שניות כל אחד עם משרעת של 30%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את lysates על ידי צנטריפוגה ב15,000 XG 10 דקות ולהעביר את supernatant ברור לצינור 15 מ&quot;ל. אם supernatant לא ברור לחזור על centrifuתהליך gation עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לשטוף את חרוזי GST-sepharose פעמיים עם PBS הקר כקרח ולהפוך את ההשעיה 50:50 של GST-sepharose בPBS. הוסף 200 μl של ההשעיה GST-sepharose לlysate תא החיידק פינה ולסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, צנטריפוגה הצינורות ב XG 500 במשך 3 דקות כדי לאסוף את חרוזים. שטוף את החרוזים 3x עם קרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, resuspend את החרוזים של חיץ elution (50 מ&quot;מ טריס pH 8.0, 150 mM NaCl, גלוטתיון 30 מ&quot;מ) 100 μl ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 15,000 XG למשך 2 דקות ולהעביר את supernatant המכיל חלבון המטוהר לעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק. לבצע אלקטרופורזה SDS ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) ניתוח על 5 μl של החלבון המטוהר יחד עם סכומים ידועים של אלבומין בסרום שור (BSA) להעריך את הריכוז של החלבון המטוהר. </li></ol> .4 מתילציה Assay הערה: בצע את השלבים הבאים באזור נפרד המיועד לעבודת רדיואיזוטופים ובהתאם לפרוטוקולים של המוסד בביצוע ניסויים עם איזוטופים רדיואקטיביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של GST-מצע מטוהר ותערובת אב המכילה מאגר מתילציה 1x (50 מ&quot;מ טריס pH 8.5, 20 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, סוכרוז 100 מ&quot;מ), 1 μCi של S-adenosyl- L- [methyl- 3 H] מתיונין, ומים לנפח סופי של 10 μl לPRMTs המשותק (שלב 2.13) ו דגירה התגובה ב30 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 μl של חיץ מדגם 2x SDS. לאחר denaturation של הדגימות על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להפריד את הדגימות על ג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוחר יותר, להעביר את החלבונים הופרדו מג&#39;ל SDS על קרום nitrocellulose באמצעות העברת electrophoretic חצי יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה, לכסות עם הקרוםutofluor (מגבר תמונת autoradiographic), ובעדינות רוק עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. , לאחר 2 שעות לשפוך את autofluor ולשמור לשימוש מאוחר יותר. [* תווית הצינור כחומר רדיואקטיבי] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר במהירות לייבש את הקרום על נייר סינון, לאטום אותו בשקית ניילון ולחשוף את הקרום לסרט X-ray ב -20 מעלות צלזיוס. זמן חשיפה מספיק נע בין 5-30 ימים. </li></ol> .5 אישור ביטוי PRMT וטוען שווים של מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהשיג חשיפות מספיק, להעביר את הקרום לקופסא פלסטיק המכילה חיץ חסימה [שנאגר מלוח טריס עם 20-Tween (TBST + חלב 3% דלי שומן)] ועדינות רוק עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את חיץ החסימה כפסולת רדיואקטיבית. דגירה הממברנה עם אנטי HA נוגדן (1: 1,000 דילול) בTBST הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם 3x TBST דגירה הממברנה עם נוגדן המשני אנטי עכבר שכותרת HRP(1: 5,000 דילול) בTBST בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשטוף את הממברנה עם 3x TBST, ולבצע זיהוי chemiluminiscence של חלבונים עם מצע HRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זיהוי של PRMTs מתויג-HA, דגירה הקרום עם פתרון מכתים Ponseau-S למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. מהר לשטוף 3x הקרום במים כדי לאתר את מצעים מתויג GST. סרוק את התמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme.">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li><li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase.">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li><li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+NG,+NG,-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions.">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li><li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+at+a+glance.">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li><li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation.">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li><li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate.">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805 (2012).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+{beta}-catenin+mRNA.">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2.">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li><li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription.">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li><li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+protein+methylation.">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li><li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation.">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li><li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+arginine+methyltransferase+7+(PRMT7)+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues.">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה משמש באופן שגרתי לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. assay חזק, ועולה בקנה אחד זה יהיה גם לספק ראיות מוחלטות על הספציפיות של PRMTs למצעים שלהם. רכיבי מפתח להצלחה של assay זה הם: .1 ביטוי של PRMTs בתאי יונקים, 2 פעילות של PRMTs המטוהר, 3 ביטוי וטיהור של מצ?...

מתילציה החלבון תוארה לראשונה בשנת 1968 1. זה לא היה עד השיבוט הראשון של PRMT1 ב -1996, כי חוקרים החלו להעריך את החשיבות של שינוי שלאחר translational זה 2. מעניין, כ -2% משאריות ארגינין בחלבונים של תמציות גרעיניות מפוגלים 3, המציינים את השפע של שינוי זה. ארגינין הוא חומצת אמינו טעונה חיובי עם צד שרשרת בסיסית והחנקן / s בתוך הרשתות בצד של ארגינין יכול להיות שלאחר translationally שונה באמצעות התוספת של קבוצה מתיל, תהליך המכונה מתילציה ארגינין 4-6. מתילציה ארגינין היא מזורזת על ידי כיתה של אנזימים דהינו., transferases תיל ארגינין חלבון (PRMTs). יכול גם להיות monomethylated Arginines או dimethylated והאחרון יכול להיות או סימטרי או לא סימטרי, תלוי בסוג של PRMTs מזרזות התהליך 4-6. חלבונים המציגים argininמוטיבים עשירים דואר גליצין הם יעדים פוטנציאליים לקטליזה בתיווך PRMT. מתילציה בתיווך PRMT של מצעים הוכח לווסת אינטראקציה בין חלבונים, אינטראקציה חומצת חלבון גרעין, תפקוד חלבון, ביטוי גנים, ו / או איתות תאית, כל אלה הם הגורמים קריטיים להומאוסטזיס סלולארי רגיל 7-9. על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של מתילציה ארגינין חלבון, מבחני מדויקים, יעיל, לשחזור נדרשים לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. ב assay מתילציה מבחנה, המעריך את היכולות של PRMTs מטוהר לזרז מתילציה של מצעים שלהם, הוא assay מקובל היטב ללימוד מתילציה ארגינין 10-12. ההצלחה הכוללת של assay זה תלוי במידה רבה על הפעילות של PRMTs המטוהר. ניתן לבטא PRMTs ומטוהר מחיידקים, או תאי יונקים 10,11. assay זה במבחנה מתילציה, כמו דetailed בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה המתוארת במקור על ידי Tini ועמיתים 10. בפרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט את השלבים כרוכים בביטוי והטיהור של PRMT1 בתאי יונקים. היכולת של PRMT1 המטוהר לזרז מתילציה בראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע 8, מאוחר יותר העריכה בנוכחות מתיונין S-adenosyl-L- [methyl- 3 ח] כ תורם מתיל. שימוש assay זה, אנו יכולים באופן מהימן להגדיר את היכולות של PRMTs לרומן methylate או מצעים ידועים, שבו הוא צעד ראשוני במחקר של מתילציה ארגינין החלבון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="673">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ecoscint ultra&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bottle top dispenser</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AutoFluor</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 ml Scintillation Vials</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>SKU:SVC-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GST-sepharose</td>
			<td style="width:136px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutathione Reduced</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Beas2B</td>
			<td style="width:136px;">ATCC</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optimem</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NP-40</td>
			<td style="width:136px;">US-Biologicals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">SDS</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PMSF</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">anti-HA affinity matrix</td>
			<td style="width:136px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tris</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nacl</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bio-rad gel doc</td>
			<td style="width:136px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">anti-HA antibody</td>
			<td style="width:136px;">roche</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ponseau S</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro methylation assay to study protein arginine methylation

מתילציה ארגינין חלבון היא אחד מהשינויים שלאחר translational הנפוצים ביותר בגרעין. מתילציה ארגינין חלבון יכולה להיות מזוהה ו / או שנקבעה באמצעות גישות proteomic, ו / או immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים מתיל-ארגינין. עם זאת, טכניקות אלה לפעמים יכולות להיות מטעות, ולעתים קרובות מספקות תוצאות חיוביות כוזבות. והכי חשוב, בטכניקות אלה אינם יכולים לספק ראיות ישירות לתמיכה בסגוליות מצע PRMT. במבחנה מבחני מתילציה, לעומת זאת, הם מבחני ביוכימיים שימושיים, שהם רגישים, ולחשוף באופן עקבי אם החלבונים שזוהו הם אכן מצעי PRMT. Assay מתילציה טיפוסי במבחנה כולל PRMTs מטוהר, פעיל, מצע מטוהר ותורם רדיואיזוטופים שכותרתו מתיל (S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין). כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לבודד PRMT1 הפעילו כקטליזאטור, בן משפחת PRMT הביע כל מקום בגוף. שליפעילויות transferase thyl של PRMT1 המטוהר נבדקו מאוחר יותר על חלבון ראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע, בנוכחות S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין כתורם מתיל. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק לא רק להקמת מעמד מתילציה של מצעי PRMT1 פיסיולוגיים רומן, אלא גם להבנת המנגנון הבסיסי של מתילציה ארגינין החלבון.

<html> היכולות של HA-PRMT1 לmethylate GST-G3BP1 נקבעו על ידי במבחנה assay מתילציה. PRMT1 מתויג-HA מטוהר מlysates תא Beas2B הועסק בתגובת מתילציה המכילה GST-G3BP1, ו1 μCi של S-adenosyl-L- מתיונין [methyl- 3 H], כתורם מתיל. PRMT1 יכול ביעילות לזרז מתילציה של GST-G3BP1 (איור 1, פנל עליון). תגובות מתילציה באמצ...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation at JoVE.com

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

15.1K Views.  University of Illinois at Chicago.  מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT י?...

Video: In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

יישום של

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic