עבודה זו מומנה על ידי מחקר למניעת עיוורון ומכונים הלאומי לבריאות מענק EY10542.

1. הכנת פרוסות רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא (עיצוב באיור 1). מקום שני אגלי שומן ואקום, במרווחים ~ 8-10 מ&quot;מ זו מזו, על פני חדר ההקלטה ליצירת ערוץ לsuperfusate ושבו כדי להטביע את פרוסות הרשתית. הוסף שני חרוז של שומן כמה מילימטרים רחוקים יותר מעבר לכל אחד משני אגלי שומן אלה לפעול כסכר וגלישת גבול. מניחים חתיכה קטנה של KimWipe משולשת בקצה של החדר, כדי להבטיח מגע עם נוזל אלקטרודה ההשוואתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פיסת קרום nitrocellulose (~ 5 x 10 מ&quot;מ; 0.8 נקבוביות מיקרומטר) שטוח על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית לשני חרוזים קטנים של שומן ואקום. יש להימנע מלמקם גריז ישירות מתחת למרכזו של קרום nitrocellulose, כמו זה יכול למנוע את הרשתית מהדבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מבצע הרקמות, לשבור את סכין גילוח קצה כפול ל -4 חתיכות ולצרף אחד לזרועות חיתוך. לחתוך פרוסה דקה של nitrocellulקרום OSE כדי להבטיח שחוד החנית של סכין הגילוח מניח שטוח נגד תא ההקלטה ולכן חותך צורה נקיה דרך קרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על כוס קטנה של תמיסת מלח דוחי (טבלת 1) על קרח בתחנה לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים סלמנדרה על ידי עריפת ראש. Hemisect ראש sagitally ושעם דרך חוט השדרה. מחצית במקומו של הראש על פיסת צמר גפן טבולה בתמיסת מלח דוחי על גבי בלוק הלינוליאום. החצי השני של הראש יכול להיות עטוף במגבת נייר לחה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר באותו היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate העין. בעזרת מספריים Vannas קטנים, לחתוך את העור המחבר את העין למסלול הסובב. לאחר שחרור הקדמי של העין מהרקמה מסלולית שמסביב, מושך את העין קדימה והחלק את המספריים מתחת לעין כדי לחתוך את שרירי העין ואת עצב ראייה, לשחרר את העין ממסלולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העין enucleated על מצע של צמר גפן עלבלוק. הלינוליאום מחק את מחצית הראש. Trim שומן מסלולית עודף מהחלק האחורי של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן במרכזה של קרנית עם להב כירורגי חד. הסר את הקרנית על ידי הזזה מספריים Vannas עדינים לתוך החתך והארכת לחתוך רדיאלית החוצה לכיוון serrata האורה. חותכים circumferentially סביב serrata האורה על ידי ההחלפה של הבלוק לינולאום או הכותנה בין קיצוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיתוך כל הדרך סביב העין, להסיר את הקרנית ואת העדשה על ידי משייכתם מהצד של עיינית. הזז את עיינית התוצאה על משטח קשה של גוש הלינוליאום טבולה בתמיסת מלח האמפיביים. לחתוך אותו לשלישים עם סכין גילוח חד בתנועות ניסור עדינות, כדי להבטיח שיש לך לחתוך את כל הדרך דרך לובן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד או שתי חתיכות של עיינית על קרום nitrocellulose עם פני שטח הרשתית פונות כלפי מטה. להטביע את החתיכות שנותרו עם מי מלח נוסף ומניח אותם במקרר ב~ 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גהntly לחץ על פיסת עיינית נגד קרום nitrocellulose עם מלקחיים עדינים. להטביע את קרום nitrocellulose וחתיכת עיינית עם כמה טיפות של מי מלח קר ודוחים כתם בקצוות עם KimWipe לעזור הרשתית לדבוק. שוב, להטביע את עיינית וקרום nitrocellulose עם כמה טיפות של תמיסה מי מלח קר דוחי ולקלף את האפיתל לובן העין / דמית העין / רשתית פיגמנט לבודד את הרשתית (שיכול להופיע ורוד בשל נוכחותם של rhodopsin מולבן). במידת צורך, לחתוך את עצב הראייה לשחרר את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הרשתית אינה דבקה בחוזקה, להתנקז המלוחים עם Kimwipe למשוך את הרשתית למטה יותר בחוזקה על קרום nitrocellulose. החלף את תמיסת מלח. חזור, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את התא עם מי מלח דוחי קר ולהעביר אותו לשלב של מבצעה הרקמה. פורסים את הרשתית וקרום nitrocellulose לרצועות דקות, עבודה מקצה אחד לקצה השני על ידי סיבוב מיקרומטר רניהבמרווחים של 125 מיקרומטר. לחץ על סכין הגילוח בעדינות אך בתקיפות דרך הרשתית וקרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פרוסות רשתית על ידי הזזת רצועות של קרום nitrocellulose לערוץ הראשי של חדר ההקלטה. הרם רצועה של קרום חופשי ולאחר מכן להחזיק אותו במקום בעת הזזת החדר מתחתיו, להיות בטוח כדי לשמור את הפרוסות מתחת למים. הטמע את הקצוות של קרום nitrocellulose ברצועות שומן ואקום, מסתובב להם 90 מעלות כדי להציג את שכבות הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ שטוחות קרום nitrocellulose כנגד משטח הזכוכית. גם אם יש לא רשתית על כל פיסה, רצועות מקום של קרום nitrocellulose במרווחי זמן קבוע (~ 1 מ&quot;מ זה מזה) לאורך כל אורכו של ערוץ זלוף כדי לעזור לשבור את מתח הפנים ולשפר את זרימת נוזל. </li></ol> 2. כל תא הקלטות לזווג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל את הפרוסות הועברו, להזיז את תא ההקלטה לשלב של זקוף, קבועהמיקרוסקופ הבמה ולצרף את ההובלה אלקטרודה ההשוואתית. להתמקד בפרוסות באמצעות מרחקים ארוכים עובדים, טבילה במים, 40-60x אובייקטיבי. מיקרוסקופ צריך להיות ממוקם על שולחן אוויר כדי לצנן את התנודות ומוקפות בכלוב פאראדיי כדי להפחית הפרעות חשמליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse את הפרוסות ברציפות בשיעור של מ&quot;ל / דקה 1 עם תמיסת מלח דוחי מבעבעים עם 100% O 2. חבר את היניקה, ולוודא כי יבוא והיצוא הם מאוזנים. יצוא יכול להיות מוסדר על ידי סיבוב הקצה המשופע של מחט השאיבה או על ידי העברת KimWipe בסוף התא קרובה יותר או רחוקה יותר ממחט יצוא. יכולה להיות כל הזמן ההכנה בטמפרטורת חדר או מקורר עם מכשיר פלטייה או פשוט על ידי קביעת שקית קרח על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הפרוסות תחת אור עמום או אינפרא אדום ולזהות זוג תאים - photoreceptor (מוט או קונוס) ותא אופקי או דו קוטבי קרוב - ליעד להקלטה כל התא. מוטות יכולות להיות אניdentified ידי גופי התא הגדולים שלהם וכמו מוט מגזרים חיצוניים בולטים (איור 2 א). קונוסים קטנים יותר ממוטות ויש מגזרים חיצוניים מחודדים קטנים. תא דו קוטבי וsomas תא האופקי הם בשורה החיצונית ביותר של גופי תא בשכבת הגרעין הפנימי (INL; דמויות 2B ו 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פרוסות, השתמש בחולץ פיפטה לייצר micropipettes מזכוכית ורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.2 מ&quot;מ, קוטר 0.95 מ&quot;מ פנימי עם חוט זכוכית). הקצה של כל micropipette צריך להיות ~ 1-2 מיקרון בקוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט מילוי לא מתכתית (לדוגמה אחד מיוצרת ממזרק 1 סמ&quot;ק או MicroFil), למלא pipettes עם הפתרון תאי (טבלת 1) ולצרף למחזיק האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרומם את מטרת מיקרוסקופ במקצת. מקם את פיפטה photoreceptor מתחת למטרה ולאחר מכן להוריד אותו כך שהקצה ממוקם בדיוק מעל את הפרוסות. חזור עם tהוא טפטפת שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם כל קיזוז ברמה הנוכחית הבסיסית על המגבר. בדקו את התנגדות פיפטה עם דופק depolarizing mV 5-10. בדרך כלל אנו משתמשים בטפטפות שהטווח 10-15 MΩ, התוצאה של להתחדד הארוך של הפיר וosmolarity הנמוך של פתרונות פיפטה דו החיים. עם פתרונות יונקים osmolarity גבוהים יותר, אותם pipettes מפגין ערכי התנגדות של ~ 8-12 MΩ. אמנם יש לנו בשימוש בקטרים ​​טיפ גדולים יותר עם ערכי התנגדות של 3-4 MΩ בפתרונות דו חיים, את היתרונות הניתנים על ידי התנגדות גישה נמוכה מתקזזים עם קשיים רבים באיטום על גבי קרום תא ומוזנח מהיר יותר של זרמי סידן ושליח שני אחר תגובות רגישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך יישום קל חיובית לחץ, עמדת פיפטה פוסט סינפטי כך שהוא קשר גוף התא האופקי או דו קוטבי. לאחר מכן מקם את פיפטה presynaptic כך שהוא קשר גוף התא של photoreceptor מוט או קונוס. הקלטות appeAR להיות יציב יותר, כאשר טיפים פיפטה לפנות המגזר הפנימי ולא הסומא, במיוחד בקונוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך מעקב ההתנגדות לשחרר את הלחץ החיובי על פיפטה פוסט סינפטי. לפעמים, על שחרורו של לחץ חיובי מספיק כדי ליצור חותם gigaohm. אם לא, תחול שאיבה עדינה עם מזרק 1 מ&quot;ל או דרך פה. לאחר התנגדות הטיפ גדלה&gt; 100 MΩ, להחיל פוטנציאל החזקת -60 mV. לאחר קבלת חותם gigaohm, null את כל עוברי קיבול פיפטה ולחזור על תהליך האיטום לפיפטה photoreceptor, החלת פוטנציאל החזקת mV -70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרע התיקון על ידי שימוש בפה שלך או מזרק ליישם יניקה לכל תא בתורו. מוטות, חרוטים, ותאים דו קוטבי יהיו בדרך כלל קרע עם שאיבה עדינה. קבלת תצורה כל תא עם תא אופקי עשויה לדרוש יניקה גדולה יותר (כלומר עם מזרק סמ&quot;ק 3) בשילוב עם פולסים מהירים מתח חזקים נמסרו עם F &quot;זאפ&quot;eature של מגבר תיקון המהדק. הקרע של הקרום והקמתה של תצורה כל התא יהיה ברור על ידי הופעתו של ארעיים קיבול כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הזהות של תא פוסט סינפטי פיזיולוגית על ידי יישום הבזק אור ומספק שורה של צעדי מתח מ-120 ל40 mV במרווחים של 20 mV (איורים 3 ו -4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך אם זוג התאים מחובר synaptically, לספק, שלילת קוטביות קצרה (25-100 אלפיות השני) 60 mV צעד לphotoreceptor (ל -10 mV, בסמוך לשיא של L-סוג סידן מתח מגודרת הנוכחי) ולחפש לזרמי פוסט סינפטיים בנוירון הצו השני (איור 5). צעד depolarizing חזק צריך לעורר נוכחי מהר, חולף פנימה פוסט סינפטי בתא דו קוטבי האופקי או OFF פוסט סינפטי הנגרם על ידי פרץ של שחרור משלפוחית ​​החרוט (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Ram&#242;n y Cajal, S., Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Structure of the Retina. , (1972).</li><li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+and+the+retina:+a+100-year+retrospective.">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li><li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina.">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li><li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina.">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina.">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li><li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses.">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li><li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+synaptic+ribbons:+how+they+are+built+and+what+they+do.">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li><li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1:+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li><li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse.">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li><li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).</li><li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation.">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina.">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina:+general+principles+and+species-specific+variations:+the+Friedenwald+lecture.">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li><li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina.">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li><li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors.">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li><li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells:+current+vs.+voltage.">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li><li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors.">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li><li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization.">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li><li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation.">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכנת פרוסה הרשתית הוכיחה מאוד שימושית לניתוח המעגלים ומנגנונים המועסקים על ידי הרשתית לעבד מידע חזותי. היכולת להשיג את כל הקלטות סלולריים בו זמנית מנוירונים לפני ואחרי סינפטי כבר מועילה במיוחד בתחום זה. שלמות הקלטות סלולריים מותאמים הרבה יותר קלה להשיג מאשר עם פרוסות בהכנות רשתית שטוח הר בגלל שכבות הרשתית השונות נחשפות. יתר על כן, משום שתאי העצב ברשתית הגדולים שלהם, יש לי סלמנדרות היסטוריה ארוכה כהכנה רשתית ולכן מספקות מערכת מודל טוב במיוחד מאופיינת. בעזרת תרגול, ניתן להכין פרוסות בריאים של רשתית הסלמנדרה באופן קבוע. כמה צעדים מרכזיים יכולים לעשות את ההבדל בין הצלחה לכישלון. 1) ודא שסכין הגילוח הוא רכוב על מבצעה הרקמה, כך שהוא מניח שטוח על משטח הזכוכית ופרוסות נקי אם כי גם הרקמה וunderlyiקרום nitrocellulose ng. אם בצע חתך נקי דרך קרום nitrocellulose, כדאי שתשמע נקישה חלושה כמו סכין הגילוח מכה את פני השטח של שקופית הזכוכית. 2) ודא שהרשתית דבקה קרום nitrocellulose. אחרת, הרשתית יכולה לצוף מן הקרום במהלך כל שלב של ההליכים. 3) אל תחשפו את הפרוסות חתוכות לאוויר, כמו זה יגרום ניזק רבים של התאים השטחיים. 4) יש לוודא את הפרוסות וקרום nitrocellulose לשכב נגד שקופיות הזכוכית, כך ששכבות הרשתית הן לכאורה תחת מיקרוסקופ לנתח. 5) לאזן את שיעורי יבוא ויצוא superfusate על מנת להימנע מגדותיו לתא ההקלטה. זה מונע שינויים פתאומיים ברמות פתרון, אשר יכול לגרום לתנועות חדות רקמה. 6) בחר זוג בריא של תאים קרובים אחד לשני. תאים עם ציטופלסמה החלקה בריאים יותר מאשר תאים עם ציטופלסמה מגורענת. תאים עמוקים יותר בפרוסה יש סיכוי גבוה יותר כדי לשמור על קון הסינפטי ללא פגעtacts. 7) ודא שהקצה פיפטה לא שבור או התחכך רקמות אחרות או פסולת בדרך למטה לתאים. 8) בדקו את התנגדות פיפטה כדי לוודא שהוא לא סתום בפסולת או בועה, שניהם יכולים לעשות את זה קשה להשיג הקלטה כל תא באיכות. במקום הצמדת הרשתית לנייר סינון nitrocellulose, כמה חוקרים להטביע רשתיות בבלוק של אגר ולהשתמש vibratome לחתוך פרוסות ברשתית. למרות שלא ניסו גישה זו, קים ואח&#39;. -11 לדון יתרונות של שתי הגישות. בניסיון שלהם, הגישה מבוססת אגר מספקת תשואה של פרוסות שטוחות עקבית יותר עם שכבות רשתית שמסומנות היטב אך גישה המבוססת על נייר המסנן מניבה קולטנית אור בריא יותר. מוטות קונוסים אחראיות לtransducing אור לשינויים בפוטנציאל הממברנה. עם הקלטות לזווג, פוטנציאל הממברנה של מוטות או קונוסים יכול להיות manipulated ישירות וכן את היכולת ליצור תגובות אור, ואילו מועיל לזיהוי סוגי תאים, לא יכול להיות חיוני. לפיכך, אנו לעתים קרובות להכין פרוסות באור לבן. עם זאת, גם כאשר הוכן תחת תאורה בהירה, תאי עצב ברשתית סלמנדרה יכול ליצור תגובות אור גדולות כפי שמודגם על ידי התגובות באיור. 3. זה נובע בחלקו מאגר גדול יחסית של chromophore בהיקף הקטע החיצוני הגדול, אלא גם עשוי לשקף את היכולת של תאים להתחדש מולר 11-cis-רשתית לקונוסים 12. כדי לקבל באופן מלא תגובות אור הכהה מותאמים, אפשר להכין את הפרוסות תחת תאורת אינפרא אדום. עבור ניתוחים תחת אור אינפרא אדום, אנו מייחסים GenIII התמונה intensifiers (NAV3 Nitemate, יטון תעשיות, בטמפה, אריזונה) לoculars של מיקרוסקופ לנתח ולהאיר את הרקמה עם פנס LED אינפרא אדום. לחיתוך והליכים אחרים שאינם נערכו תחת מיקרוסקופ לנתח, אנו מעסיקים הר&quot;י ראש רכובמגבר GE. עבור מיקום של את pipettes התיקון, אנו לדמיין פרוסות באמצעות מצלמת CCD אינפרא אדום רגישה (למשל WATEC 502H, WATEC Inc, מידלטאון, ניו יורק) רכוב על מיקרוסקופ הזקוף, קבוע הבמה. עם אמצעי הזהירות הבאים, ניתן לקבל תשובות מוט מפגינות רגישות פוטון יחידה 6, 13. מגבלה אחת של עבודה בפרוסות רשתית היא שתהליכים תאיים ארוכים של תאי עצב ברשתית שדה גדולים עלולים לאבד רבים מהדנדריטים שלהם במהלך הליך החיתוך. הכנות פרוסה רשתית ולכן שימושיות יותר ללימוד הפיסיולוגיה של תאים שבו הקשרים סינפטיים כוללים תהליכים קרובים לגוף התא. רשתיות דו חיים ויונקים חולקים רבות מאותם סוגי תאים ולנצל מנגנונים פיסיולוגיים דומים 14-16. בעוד רשתית סלמנדרה היא מודל טוב להיבטים רבים של רשתית של יונקים, הבדל חשוב אחד נראה הנוכחות של מסלול מוט ייעודי ביונקים שinvoקשר lves של תאים מיוחדים על גבי המוט דו קוטביים איי תאי amacrine 14. מגבלה נוספת של רשתית הסלמנדרה היא המספר הקטן של כלים גנטיים שפותחו במיוחד עבור מין זה. עם זאת, נוגדנים וחומרים כימיים שshRNA אזורי היעד נשמרים היטב במינים אחרים יכולים לשמש בהצלחה בסלמנדרה, כפי שניתן רבים מעכבי מולקולה קטנים וריאגנטים פפטיד. בנוסף, עם כמה שינויים בטכניקה, אפשר להכין פרוסות רשתית ממינים אחרים שבו חלק מהכלים אלה הם זמין יותר. מעבר לשירות שלה להקלטה כל התא לזווג, הכנת פרוסה רשתית הסלמנדרה היא גם נוחה למגוון של גישות אחרות. כאמור לעיל, ניתן להשתמש בפרוסות רשתית ללמוד תגובות אור בשילוב עם פרוטוקולי מהדק מתח שונים 17. יכולים גם להיות טעונים נוירונים ברשתית עם צבעי ניאון רגישים לCa 2 +, Cl -, או Na+ הציג באמצעות פיפטה את התיקון או על ידי מרחץ יישום 15,18-20. יכול להיות הציג פפטיד ניאון שנקשר לסרט הסינפטי 21 באמצעות פיפטה את התיקון ומשמש להדמית סרט או 10, כאשר מצומד להעמסה, לחריפות ולפגוע באופן סלקטיבי 22 סרט. יש לנו גם בשימוש פרוסות ברשתית בשילוב עם נקודות קוונטיות כדי לפקח על התנועות של ערוצי סידן בודדים במוט וקונוס מסופים הסינפטיים 23. לפיכך, הפרוסה האנכית הרשתית היא תכשיר ניסיוני תכליתי ללימוד מנגנונים סינפטיים בסיסיות ואת פונקציות העיבוד הייחודיות שבוצעו בסינפסה הראשונה במסלול האיתות החזותי.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

אחת המשימות המרכזיות במדעי מוח רשתית הוא להבין את המעגל החשמלי של תאי עצב ברשתית וכיצד קשרים אלה אחראים לעיצוב את האותות המועברים למוח. פוטונים מזוהים ברשתית על ידי מוט וקונוס קולטני אור, הממיר את האנרגיה הזאת לאות חשמלי, שמסר אותה לתאי עצב אחרים ברשתית, שם הוא מעובד ומועברים ליעדים מרכזיים במוח דרך עצב הראייה. תובנות מוקדמות חשובות לתוך מעגלי רשתית ועיבוד חזותי באו מהמחקרים היסטולוגית של 1,2 Cajal, ומאוחר יותר, מהקלטות אלקטרו של פעילות spiking של תאי הגנגליון ברשתית - תאי הפלט של הרשתית 3,4. הבנה מפורטת של עיבוד חזותי ברשתית דורשת הבנה של האיתות בכל שלב במסלול מphotoreceptor לתא הגנגליון ברשתית. עם זאת, הרבה סוגי תאים ברשתית הם ספחתמטען חבלה עמוקה ברקמה ולכן נגיש יחסית להקלטת אלקטרו. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי עבודה עם פרוסות אנכיות, שבו תאים המתגוררים בתוך כל אחת משכבות הרשתית הם נראים בבירור ונגישים עבור הקלטת אלקטרו. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע סעיפים אנכיים של רשתית מזחל נמר סלמנדרות (Ambystoma tigrinum). אמנם הכנה זו פותחה במקור עבור הקלטות עם microelectrodes החדים 5,6, אנו מתארים שיטה להקלטות מהדק מתח כל תא כפולים מקולטניות אור ותאים אופקיים ודו קוטביים שני מסדר שבו אנו לתפעל פוטנציאל הממברנה של photoreceptor בעת הקלטה בו זמנית לאחר תגובות הסינפטי בתאים אופקיים או דו קוטביים. את קולטני האור של סלמנדרת הנמר הוא הרבה יותר גדול מאלה של מיני יונקים, מה שהופך את זה הכנה אידיאלית שבו יתחייב לאהגישה הניסויית המאתגר מבחינה טכנית שלו. ניסויים אלה מתוארים עם עין לכיוון לחקור את המאפיינים של איתות סרט סינפטי - סינפטי מבנה מיוחד שנמצא ברק קומץ של תאי עצב, כולל מוט וקונוס קולטני אור, שהוא גם מתאים לשמירה על שיעור גבוה של טוניק שחרור הנוירוטרנסמיטר 7 , 8 - ואיך זה תורם למאפיינים הייחודיים של איתות סינפסה הרשתית הראשונה הזה.

עקבות נציג של תגובות אור מתאי עצב ברשתית פרוסות אנכיות של סלמנדרה מוצגות באיור 3. קונוס, התא אופקי, וOFF התא דו קוטבי כל להציג כלפי חוץ נוכחי, בתגובה להופעת אור. בולט פנימה הנוכחי בעקבות הבזק האור בהקלטות התא האופקיות ודו קוטביות נגרמת על ידי השחרור המוגבר של גלוטמט מקולטני אור כפי שהם depolarize באור קיזוז. בתא דו קוטבי מגיב עם זרם פנימה בתחילת האור כתוצאה ממפל הכניסה היפוך metabotropic גלוטמט רצפטור איתות והפעלה של TRPM1 ערוצים 9. ניתן להבדיל בין אחד לשני תאים אופקיים ותאים דו קוטביים במערכות היחסים שלהם IV (איור 4). תאים אופקיים יש התנגדות מבוא ליניארי או פנימי לתיקון הרביעי ונמוכה (&lt;500 MΩ; איור 4 א) בדרך כלל, בעוד שהתאים דו קוטבי התנגדות כניסה גבוהה(0.5-2 GΩ) ו- תיקון כלפי חוץ אני - V (איור 4) איור 5 מציג תוצאות נציג מהקלטות של זוג תא חרוט אופקי (איור 5 א) וזוג תא דו קוטבי חרוט OFF (איור 5).. בכל אחד, depolarizing קונוס ל-10 mV מפוטנציאל החזקת mV -70 עורר סיד מתח מגודרת נוכחי בחרוט וEPSC פנימה מהר בתא האופקי או דו קוטבי. גירוי חזק זה מספיק כדי לרוקן את בריכת בקלות-releasable של ~ 20 שלפוחית ​​מסרט הסינפטי, וכתוצאה מכך EPSC של 47 ~ רשות / סרט 10. EPSC התא האופקי באיור 5 א היה 232 הרשות הפלסטינית, מה שמרמז שהוא קיבל 5 מגעי סרט מקונוס presynaptic. הערכה דומה מהרשות הפלסטינית EPSC 178 בתא דו קוטבי מחוץ (איור 5) מצביעה על כך שהוא קיבל 4 קשרי סרט מקונוס presynaptic. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td><sטרונג&gt; דוחים מלוחים </td><td> פיפטה presynaptic </td><td> פיפטה postsynaptic </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 מ&quot;מ </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1.8 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 5 מ&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CS-גלוטמט * </td><td></td><td> 40 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> CS-גלוקונאט ** </td><td></td><td> 50 מ&quot;מ </td><td> 90 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> כלוריד Tetraethylammonium </td><td></td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 מ&quot;מ </td><td> 9 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0.5 מ&quot;מ </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> PH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolarity **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * CS-גלוטמט נעשה על ידי נטרול חומצת 40 מ&quot;מ L-גלוטמית עם CsOH 40 מ&quot;מ בפתרון פיפטה. ** מניית ז 1 של CS-גלוקונאט נעשית על ידי נטרול פתרון של CsOH עם 45-50% חומצת D-gluconic. *** ה-pH צריך להיות מותאם עם NaOH לפתרון וCsOH תאיים עבור פתרונות פיפטה. **** שמירת osmolarity מפתרונות פיפטה בדיוק מתחת לזה של הפתרון תאי מונע נפיחות תא ומשפר את תוחלת חיים של ההקלטה. שולחן1. רכיבים ופרמטרים לפתרונות תאיים וחוץ תאיים הסטנדרטיים המשמשים בפרוטוקול זה. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> איור 1. עיצוב תא הקלטה. (AC) למעלה, בצד, ונוף של חתך של תא ההקלטה מראה ממדים. הקאמרית הוא מכונה מחתיכה עבה 2 מ&quot;מ של אקריליק. (ד &#39;) קאמרי מורכב. Superfusate נכנס לתא דרך אורך 10 ס&quot;מ של צינורות טפלון (צינור זרימה; סוג 24LW). Superfusate יוסר על ידי יישום יניקה קלה לצינור מתכת מד 20 המשופע בצד השני של החדר. בסמוך לצינור פלט זה היא אלקטרודה השוואתי גלולה Ag / AgCl. להוביל מאלקטרודה השוואתית זו קשורה להתייחסות של קלט headstage. משולש קטן של KimWipeממוקם מעל אלקטרודה ההשוואתית כדי לשמור אותו במגע עם הפתרון ולווסת את זרימת פתרון לצינור יצוא. הבסיס של החדר נוצר על ידי הצבת שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לתוך הקצוות השקועים של החדר. השקופית שנערכה במקום עם חרוז של שומן ואקום. רצועות של קרום nitrocellulose עם פרוסות רשתית משובצות באגלי שומן ואקום שיוצרים ערוץ לפתרון לזרימה. לפני קבלת פרוסות, חתיכת 5 מ&quot;מ x 10 מתוך קרום nitrocellulose מודבקת בחדר עם שני חרוזים קטנים של שומן ואקום. חתיכת עיינית ממוקמת צד vitreal על קרום nitrocellulose זה והרימה משם פעם אחת את שומרת הרשתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> איור 2. זוגות סלולריים מלאים בצבע ישהכנת פרוסה rtical.) תמונות של מוט ותא אופקי synaptically המצמיד שהיו מלאים בניגודי צבעי ניאון הציגו באמצעות פיפטה את התיקון בזמן הקלטה כל התא בו זמנית. לוציפר צהוב (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) נכלל בפתרון פיפטה המוט (צהוב) וsulfarhodamine ב &#39;(1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) נכלל בפתרון פיפטה התא האופקי (סגול). תמונות ניאון נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב (פרקין אלמר UltraView LCI) מצויד במצלמת CCD מקוררת (אורקה ER) ועלה לבמת מיקרוסקופ הקבוע (ניקון E600 FN עם 60x, מטרת טבילה במי NA 1.0). תמונות אלה מעולף על תמונות שדה בהירות של פרוסות הרשתית המתאימות באמצעות Adobe Photoshop. ב &#39;) תמונות של חרוט וsynaptically מצמידים OFF תא דו קוטבי. מסוף האקסון התא דו קוטבי ramifies בsublamina (S1) החיצונית ביותר של השכבה הפנימית plexiform סמוך לגבול עם שכבת הגרעין הפנימית. <strong&gt; C) תמונות של חרוט ותא אופקי synaptically מצמידים. שימו לב שמסופי קונוס הם הרבה יותר גדולים ממסוף האקסון של המוט. למרות שניתן לזהות תאים אופקיים על ידי צורה המלבנית של גופי התא שלהם, גופי תא של-ON ולא ניתן להבחין בין תאים דו קוטביים מסוג OFF בINL קלות לפני ההקלטה. עם זאת, אפשר היעד נעקר חרוט מונע את התאים דו קוטביים שבו יש גופי תא בONL וניתן להבחין בין קונוסים בהעדר מגזרים פנימיים וחיצוניים. סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> איור 3. אור עורר זרמים שנרשמו תחת מהדק מתח מארבעה תאי עצב ברשתית שונים בתגובה ל500 אלפיות שני בהיר הבזק של אור לבן. קונוס (א &#39;), תא אופקי <stronG&gt; (ב &#39;), ואת התא דו קוטבי (C) כל הגיב להדליק עם נוכחי כלפי חוץ. (ד&#39;) על התא דו קוטבי הגיב לאותו גירוי אור עם זרם פנימה. רעש תחילת המחקר הוצג על ידי התא דו קוטבי מ( C) משקף שחרור מתמשך של השלפוחית ​​סינפטית בחושך שפוחת כאשר קולטני אור hyperpolarize באור. תגובות מארבעה תאים אלה התקבלו בהקלטות נפרדות באמצעות פרוסות שהוכנו תחת אור לבן. עוצמת גירוי האור הלבן השתמש בדוגמאות אלה מיוצרות תגובות בתאים אופקיים ודו קוטביים שווי ערך ל 580 ננומטר שטף פוטון של 1 x 10 5 פוטונים / שני / 2 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> איור 4. (IV) יחסים נוכחי מתח של שעותתאים דו קוטבי ואת פקי. () פנל עליון, זרמים הממברנה עוררו על ידי סדרה של 150 צעדי מתח msec מ-120 ל +40 mV מיושם במרווחים של 20 mV (פנל תחתון) לתא אופקי. תאים אופקיים בדרך כלל יש התנגדות כניסה נמוכה ויחסי IV ליניארי או פנימי לתיקון. (ב) יחסי IV של תא דו קוטבי בתגובה לשורה של צעדי מתח. יש תאים דו קוטבי עמידות גבוהה יותר וקלט IV כלפי חוץ תיקון, עקב ההפעלה של זרמי אשלגן מתח מגודרת. <img alt="איור 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות של הקלטת נתונים מותאמים. (א) הקלטה של זרם סיד מתח מגודרת קונוס (חרוט אני Ca </sUB&gt;) בתגובה לצעד 100 אלפיות שני ל-10 mV מפוטנציאל החזקת -70 mV (קון V מ &#39;). דליפה ארעיים וקיבול נגרעו באמצעות P / 8 דליפת חיסור פרוטוקול. מהר מעורר פוסט סינפטי הנוכחי (EPSC; בג&quot;צ PSC) נרשם בו זמנית מתא אופקי, מראה כי שני תאים אלה הם מצמידים synaptically (ב &#39;) EPSC נרשם בתא דו קוטבי בתגובה לאותו הגירוי באחר. קונוס.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation at JoVE.com

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) ולהסביר כיצד אנו משתמשים בפרוסות אלה ללמוד עיבוד הסינפטי ברשתית על ידי קבלת הקלטות מהדק מתח כל תא כפולים מקולטניים אור ותאים אופקיים ודו קוטביים שני מסדר.

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Nebraska Medical Center. אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות ( Ambystoma tigrinum) ולהסביר כיצד אנו משתמשים בפרוסות אלה ללמוד עיבוד הסינפטי ברשתית על ידי קבלת הקלטות מהדק מתח כל תא כפולים מקולטניים אור ותאים אופקיים ודו קוטביים שני מסדר.

Video: Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...